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巨噬細(xì)胞清除劑（Clodronate Liposomes）
——體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除利器,，高效、迅捷
巨噬細(xì)胞的清除（Depletion of macrophages）,，是全面了解巨噬細(xì)胞在病理?xiàng)l件下功能的一種十分有力的研究方法,，氯膦酸鹽脂質(zhì)體（Clodronate Liposomes）是目前最為成熟,，方便,，經(jīng)濟(jì)的一種巨噬細(xì)胞清除工具,，可以有效的清除動(dòng)物體內(nèi)不同組織部位和血液中的巨噬細(xì)胞。
氯膦酸二鈉（Clodronate）是一種雙膦酸鹽藥物,，在臨床上主要用于癌癥引起的溶骨性骨轉(zhuǎn)移,、骨質(zhì)疏松癥和高鈣血癥,。其作用機(jī)理是氯膦酸二鈉在細(xì)胞內(nèi)代謝成不可水解的ATP類似物，抑制線粒體中的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,，從而阻斷線粒體呼吸鏈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,。但是該藥物親脂性低，不能跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn),，在口服或是靜脈給予游離藥物后,，2小時(shí)后即可達(dá)半衰期，48小時(shí)內(nèi)80%藥物隨尿液排出,。
脂質(zhì)體是單層或多層脂質(zhì)雙分子層的球形囊泡,，其主要成分是磷脂和膽固醇。脂質(zhì)體本身具有雙分子層結(jié)構(gòu),，組成成分無毒性，因此可以作為運(yùn)輸分子物質(zhì)的載體,，它通過與細(xì)胞膜結(jié)合的方式將分子物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi),。
圖1：氯膦酸-脂質(zhì)體（Clodronate liposomes）復(fù)合物
氯膦酸鹽包裹進(jìn)磷脂體的水相中形成氯膦酸鹽脂質(zhì)體，氯膦酸鹽不能自由的通過脂質(zhì)體磷脂體雙分子層,。注射到生物體內(nèi)后,，氯膦酸鹽脂質(zhì)體會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬，在巨噬細(xì)胞內(nèi)的溶酶體磷酸酶的作用下,，溶解在脂質(zhì)體內(nèi)的氯膦酸鹽會(huì)被逐步釋放出來并在細(xì)胞內(nèi)積累,，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，巨噬細(xì)胞將會(huì)受到不可逆損傷,，誘發(fā)細(xì)胞凋亡,。死亡細(xì)胞內(nèi)的氯膦酸鹽會(huì)被釋放到細(xì)胞外，隨尿液排出體外,。
圖2：巨噬細(xì)胞清除劑原理示意圖
1 mL脂質(zhì)體體懸液中所含的氯膦酸大約為5 mg,，脂質(zhì)體直徑為1.5-2μm。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4,，10 mM NaH2PO4,，140 mM NaCl。
1,、必須使用無菌操作從小瓶中取出產(chǎn)品,，如果無菌性受損，請勿使用,。
2,、當(dāng)靜置超過幾個(gè)小時(shí)后，脂質(zhì)體可能會(huì)沉淀,，在使用之前,，為了確保脂質(zhì)體懸浮液均勻,，緩慢倒轉(zhuǎn)小瓶數(shù)次，直到懸浮液均勻,，不要?jiǎng)×覔u晃或震動(dòng),。
3、在注射氯膦酸脂質(zhì)體后數(shù)小時(shí)內(nèi),，動(dòng)物免疫能力開始下降,，注意動(dòng)物健康狀況，以防止與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的感染,。
4,、如果研究使用免疫缺陷小鼠預(yù)計(jì)會(huì)有很高的死亡率。
5,、靜脈給藥時(shí),，請將藥物加熱至室溫（18 ℃），并去除注射器中的氣泡,，緩慢注射,，如果動(dòng)物表現(xiàn)出任何異常反應(yīng)，請降低注射速度,。
6,、脂質(zhì)體應(yīng)保存在4 °C，切勿冷凍,。
尾靜脈注射方法：
1,、將小鼠固定，拉出尾巴,，小鼠的尾部有2條動(dòng)脈和3條靜脈,，2條動(dòng)脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面，3條靜脈呈品字型分布,，一般采用左右兩側(cè)的靜脈,；
2、將紗布浸泡于約70 ℃溫水中,，拿出后包裹尾巴,，使尾部血管擴(kuò)張并軟化表皮角質(zhì)；
3,、尾部靜脈注射時(shí),，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2 cm一段,，使皮膚緊張,，靜脈更為充盈，右手持1 mL針頭注射器,，使針頭與靜脈平行(小于30°角),，從尾巴的下1/4處進(jìn)針,。開始注入藥物時(shí)應(yīng)緩慢，仔細(xì)觀察,，如果無阻力,，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管,，可正式注入藥物,。
4、如需連續(xù)尾靜脈注射給藥,，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始,，按次序向尾根部移動(dòng)，更換血管位置注射給藥,。拔出針頭后,，用棉球按住注射部位輕壓1-2 min，止血,。
注：以上操作方法和劑量使用僅供參考,，不同的實(shí)驗(yàn)請自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案或是參考相關(guān)文獻(xiàn)。
參考案例一：
圖3： 左圖是正常小鼠肝臟免疫細(xì)胞中Kupffer細(xì)胞的比例,，右圖是注射Clodronate Liposomes 48小時(shí)后Kupffer細(xì)胞的比例，可以看到Kupffer細(xì)胞基本被清除[1],。
參考案例二：
圖4： 上圖是小鼠LLC細(xì)胞肺癌成瘤實(shí)驗(yàn)中正常腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞（紅色熒光）,，下圖是氣管灌注Clodronate Liposomes腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞（紅色熒光），可以看出腫瘤中的巨噬細(xì)胞基本被清除[2],。
靶向器官/細(xì)胞 | 實(shí)驗(yàn)方法 |
脾臟/紅髓區(qū)巨噬細(xì)胞 | 單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射） 長期耗竭：第一次給藥150 μL/小鼠,，之后每隔兩周給藥100 μL/小鼠 |
肝臟/Kupffer細(xì)胞 | 單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射） 長期耗竭：第一次給藥劑量150 μL/小鼠，以后按照兩周一次給藥100 μL/小鼠 |
肺/肺泡巨噬細(xì)胞 | 靜脈注射（150-200 μL）聯(lián)合氣管或鼻內(nèi)（50 μL）給藥獲得最佳效果 |
淋巴結(jié) | 注射（100-200 μL）/小鼠,，具體給藥方式可參考文獻(xiàn) |
腦/小膠質(zhì)細(xì)胞 | 腦室腦脊液注射,，10 μL/小鼠，50 μL/大鼠 |
注：本劑量僅供參考,，請根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求使用或參考文獻(xiàn),。
Q1:收到Clodronate liposomes后該如何操作？
A:收到氯膦酸脂質(zhì)體后,，如果不能馬上使用,，需要放置在4 ℃冰箱。禁止凍存,！使用時(shí)作為原液使用,，不能進(jìn)行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀,，建議使用之前輕輕混勻,，另外4 ℃的氯膦酸脂質(zhì)體不能馬上使用,，需要恢復(fù)到室溫才能進(jìn)行注射。
Q2:如何將脂質(zhì)體從小瓶中轉(zhuǎn)移出來,？
A:從小瓶中轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體的最佳方法是使用無菌針頭注射器,。這樣小瓶中剩余的脂質(zhì)體懸浮液就可以保持密封和清潔。您也可以使用帶有無菌吸頭的移液器進(jìn)行轉(zhuǎn)移,，但最好在潔凈的環(huán)境中進(jìn)行,，例如在BSC罩中。
Q3: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細(xì)胞清除,？
A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細(xì)胞的清除,，但是這種方法比較適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。主要是由于在體外培養(yǎng)過程中,，從死亡細(xì)胞釋放的氯膦酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏"出來氯膦酸,，會(huì)一直存在于培養(yǎng)基中，但是在體內(nèi),，氯膦酸的半衰期很短,，很快就會(huì)被腎臟清除。雖然游離的氯膦酸不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞也不會(huì)進(jìn)入脂質(zhì)體,，但是一旦他們在培養(yǎng)基中積累就會(huì)慢慢地進(jìn)入細(xì)胞中,。
Q4:在靜脈注射Clodronate liposomes后動(dòng)物很快就死亡了，是什么原因,？
A:一方面有可能是動(dòng)物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液,。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質(zhì)體在體外一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生沉降,。如果在很長一段時(shí)間內(nèi)需要一次注射多只動(dòng)物,，那么脂質(zhì)體便會(huì)在注射器中發(fā)生沉淀，形成不均一懸液,，這樣一來,，第一只注射的計(jì)量與最后一只注射的計(jì)量就會(huì)發(fā)生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后,，沒有恢復(fù)到室溫,。
Q5:動(dòng)物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了？
A：這個(gè)可能是受到細(xì)菌的污染,，體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞后會(huì)增加例如病毒粒子,，細(xì)菌或者酵母感染的幾率。
Q6:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細(xì)胞并沒有*消失,？
A：大鼠中成熟的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)ED1和ED2雙陽性,，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細(xì)胞也是ED1+，但是呈現(xiàn)ED2-。因此,，所有ED2+的細(xì)胞都可以被*清除,，但是ED1+的細(xì)胞卻只能被部分清除，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細(xì)胞的比例,。
Q7: Clodronate liposomes沒有達(dá)到期望的效果,？
A：氯膦酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn)，每批次都會(huì)對氯膦酸的濃度以及一些可能的污染物進(jìn)行檢測,，確保無誤后才會(huì)銷售給客戶,。另外，脂質(zhì)體容易收到溫度的影響,。正確的運(yùn)輸和儲(chǔ)存方式是4~8 ℃,，懸液既不能被凍存，也不能被加熱超過30 ℃,。自收到貨物起,，需要在3個(gè)月內(nèi)使用完，不然有可能會(huì)影響使用的效果,。
Q8:在靜脈注射時(shí),，能不能增加注射的體積？
A：靜脈注射時(shí)需要依據(jù)動(dòng)物的體重,，不能超過0.1 mL/10 mg,，但是進(jìn)行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點(diǎn)的容量進(jìn)行決定,。
Q9:使用脂質(zhì)體應(yīng)注意的一些事項(xiàng),？
A：通過具有飽和烴鏈的脂質(zhì)制備而來的脂質(zhì)體實(shí)際上非常堅(jiān)固，但仍需要注意以下一些事項(xiàng),。
①不要與有機(jī)溶劑混合，如氯仿,、甲醇,、乙醇、DMSO等,。
②不要添加表面活性劑,，除非您必須要這樣做以裂解脂質(zhì)體。
③不要加熱,、接近或高于脂質(zhì)主相轉(zhuǎn)變溫度,，除非進(jìn)行藥物加載，這需要在相變溫度以上進(jìn)行孵育,。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
Clodronate Liposomes（From Vrije Universiteit Amsterdam）體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑 | 40337ES08/10 | 5 mL/10 mL | 3152/5132 |
Control Liposomes（PBS）體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑空白脂質(zhì)體對照 | 40338ES05/10 | 5 mL/10 mL | 1652/2252 |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit 蘇木素伊紅（H&E）染色試劑盒 | 60524ES60 | 2×100 mL | 358 |
Prussian Blue Iron Stain Kit普魯士藍(lán)染色試劑盒（鐵染色） | 60533ES20/60 | 20 T/100 T | 388/1288 |
參考文獻(xiàn)：
[1]: Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.
[2]: Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.
