波多野结衣色色色,日韩av动作片在线观看日韩国产在线一区

翌圣生物科技（上海）股份有限公司

初級會員·13年

聯(lián)系電話

400-6111-883

您現(xiàn)在的位置：首頁> 技術文章 > 雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)~實驗操作篇

產(chǎn)品分類品牌

耗材

翌圣生物科技（上海）股份有限

初級會員·13年

聯(lián)系人：: 曹女士

電話：: 400-6111-883

手機：

售后：: 4006-111-883

傳真：: 86-21-34615995

地址：: 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓

網(wǎng)址：: www.yeasen.com

在線咨詢給我留言

掃一掃訪問手機商鋪

雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)~實驗操作篇

2021-10-12　　閱讀(338)

雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)~實驗操作篇

自1990年螢光素酶生物傳感器技術誕生以來,，單螢光素酶檢測系統(tǒng)到雙螢光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展,，為科研人員提供了更為嚴謹?shù)膶嶒炇侄巍ｋp螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在單報告基因的基礎上引入了“內(nèi)參對照"報告基因,，可以排除不同組之間細胞生長狀況,、細胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用,，從而使實驗結(jié)果更為可靠,。今天小翌將從雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的原理與應用開篇，給大家分享雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的實驗操作流程,。

一

雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)原理

螢火蟲螢光素酶是一種胞內(nèi)蛋白,，大小為61KDa。在氧氣,、ATP和鎂離子同時存在的條件下,，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素,，并發(fā)出黃綠色光,，其*發(fā)光波長為560nm。

海腎螢光素酶也是一種胞內(nèi)蛋白,，大小為36KDa,。只需要氧氣就可以催化腔腸素,，氧化生成高能產(chǎn)物coelenteramide，并發(fā)出藍光,，其*發(fā)光波長為465nm,。

海腎熒光素酶.jpg

二

雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)應用

◆ microRNA研究

在報告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用來檢測miRNA對于目的基因的調(diào)控（抑制作用）,，報告基因表達越少,，說明miRNA的作用就越強。

◆ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究

在報告基因的5'端加上待檢測基因的啟動子,，就可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用,，啟動轉(zhuǎn)錄越多，那報告基因的表達量就越大,，熒光值越高,。

◆ 啟動子研究

將啟動子區(qū)域序列進行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c進行突變,，再分別構建到luciferase報告載體中,，檢測其啟動子活性。

◆ 信號通路研究

信號通路的激活/監(jiān)測基因的表達水平,。

......

三

雙螢光素酶報告基因檢測實驗操作流程

報告基因檢測流程主要有4個模塊：分別是質(zhì)粒構建,、細胞轉(zhuǎn)染、報告基因檢測和數(shù)據(jù)分析,。

質(zhì)粒構建

雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)一般將螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒和海腎螢光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞,，或?qū)⑦@兩個報告基因構建到同一個骨架質(zhì)粒上（如pGL4質(zhì)粒），分別用不同的啟動子啟動其表達,。

◆ 主報告基因載體的選擇

根據(jù)實驗目的選擇對應的載體骨架,。

如果是基因調(diào)控研究，需要選擇不帶啟動子或其他調(diào)控元件的骨架載體,。如果研究啟動子強弱或轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用,，那么就在該螢光素酶的5'端加上待檢測啟動子序列或者有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的啟動子（下圖左）。如果想檢測miRNA對于目的基因的抑制作用,，就可以在螢光素酶3'端加上目的基因的3'UTR（下圖右）,。

3'UTR-1.jpg

3'UTR-2.jpg

◆ 內(nèi)參報告基因載體的選擇

帶有表達組成型啟動子的螢光素酶表達載體作為內(nèi)參。

不同的載體帶有的啟動子不同,，通常啟力：CMV＞SV40＞PGK＞TK,。通常內(nèi)參基因表達的活性應當顯著的高于背景組，同時,，盡量小,，確保不干擾主報告基因的表達。所以一般選擇內(nèi)參載體時，首先考慮活性較弱的TK啟動子載體,，如果表達量過低,，再考慮其他類型的啟動子或者構建自己需要特殊的啟子。

細胞轉(zhuǎn)染

◆ 轉(zhuǎn)染細胞系選擇

根據(jù)不同細胞系大小和生長速度選擇初始密度（混合度在80-90%）,。

◆ 轉(zhuǎn)染方法選擇

根據(jù)實驗目的選擇瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,。對于短期表達的目的基因產(chǎn)物，可以選用瞬時轉(zhuǎn)染法,，操作更為簡便,。對于需要長期穩(wěn)定表達目的基因產(chǎn)物，建議選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法,，穩(wěn)定性更好,。

◆ 轉(zhuǎn)染報告基因比例

主報告基因：內(nèi)參報告基因=10:1-100:1。

◆ 啟動子和轉(zhuǎn)錄因子比例

啟動子和轉(zhuǎn)錄因子比例一般為1:9,。

◆ 核酸與轉(zhuǎn)染試劑的比例

從1:2開始調(diào)整,，另外，注意質(zhì)粒的純度,、完整度和去內(nèi)毒素,。

報告基因檢測

◆ 檢測試劑選擇

◆ 檢測板選擇

◆ 檢測儀器選擇

檢測儀器：發(fā)光檢測儀（Luminometer），或帶有發(fā)光檢測模塊的多功能酶標儀,。

發(fā)光模式：化學發(fā)光（Luminescence）,。

檢測類別：終點法檢測。

波長范圍：無需設置波長,，如需選擇，推薦全波長380-780 nm,。
注：只選擇在最大波長處檢測發(fā)光,，過濾掉其他發(fā)光信號，意味著檢測會丟掉很多信號,，丟失靈敏度,。

讀取模式：底讀或頂讀。

檢測時間：輝光型0.5-1 sec,，閃光型2-10 sec,。

數(shù)據(jù)分析

通過儀器可以直接讀出螢火蟲和海腎螢光素酶的數(shù)值，兩種熒光值讀數(shù)不少于4位數(shù),，讀數(shù)大于8位數(shù)時,，需要稀釋裂解上清（讀數(shù)與細胞種類、細胞狀態(tài),、轉(zhuǎn)染方法,、轉(zhuǎn)染時間等因素相關）。

相對表達倍數(shù)具體計算公式如下：

歸一化值=螢火蟲螢光素酶讀值（主報告基因）/海腎螢光素酶讀值（內(nèi)參基因）

相對表達倍數(shù)=實驗組歸一化值/對照組歸一化值

給大家舉個例子：

分類	F-Luc	R-Luc	歸一化（F/R)	平均值	相對表達倍數(shù)
對照組1	20118	50201	0.400748989	0.420043613	1
對照組2	18919	48091	0.393400012
對照組3	21910	47019	0.465981837
實驗組1	60129	60911	0.987161596	1.226184349	2.919183
實驗組2	87927	56873	1.546023596
實驗組3	78791	68791	1.145367853

通過計算以上公式計算，實驗組表達量是對照組的2.92倍,。

寫到這里,，雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的實驗操作篇就給大家分享完了，大家對這個實驗是否有更進一步的了解啦,！如果您在實驗操作過程中還有其他問題歡迎留言哦~

下期小翌將會結(jié)合大家的留言進一步分享~

最后小翌給大家分享一下Yeasen螢光素酶報告基因檢測的解決方案,，每一步都能幫到您！

相關產(chǎn)品

類別	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號
螢光素酶報告基因載體	Luciferase Reporter Plasmid negative control 螢光素酶報告基因質(zhì)粒陰性對照	11555ES03
	pGM-CMV Luciferase Reporter Plasmid Positive Control pGM-CMV-Luc螢光素酶報告基因質(zhì)粒陽性對照	11556ES03
	pGMLR-TK Luciferase Reporter Plasmid pGMLR-TK海腎螢光素酶報告基因質(zhì)粒	11557ES03
轉(zhuǎn)染試劑	Hieff Trans™ Liposomal Transfection Reagent 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑	40802ES02/03/08
血清	Fetal Bovine Serum Origin South America Gold 胎牛血清（南美特級）	40130ES25/76
支原體檢測	MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit 一步法快速支原體檢測試劑盒	40612ES25/60
單/雙螢光素酶報告基因檢測試劑	Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒	11401ES60/76/80
	Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒	11402ES10/60/80
	Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒	11404ES10/60/80
	Dual Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒	11405ES10/60/80