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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何評(píng)估RNA質(zhì)量,？
RNA濃度評(píng)估
首先我們先來(lái)復(fù)習(xí)一下OD260,、OD280、OD230的含義,。核酸分子所含的嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵,，在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，因此,，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm,，但它無(wú)法區(qū)分出DNA、RNA,、降解核酸,、游離核苷酸等雜質(zhì)；蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸,、色氨酸,、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，通常在280nm處有最大吸收峰,；而碳水化合物,，多肽，苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰則在230nm處,，如圖1,。
圖1. 核酸、蛋白質(zhì),、污染物的最大吸收峰（圖源網(wǎng)絡(luò)）對(duì)于RNA的濃度來(lái)說(shuō),，根據(jù)朗伯-比爾定律可計(jì)算出在波長(zhǎng)260nm的紫外線下，1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于40µg/ml的RNA[1],，即RNA的濃度（µg/µl）= OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000,。比如OD260為0.16，2µl樣本稀釋至200µl,，即稀釋倍數(shù)為100,，RNA的濃度（µg/µl）= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。
RNA純度評(píng)估
1）OD260/280<1.8，可能有蛋白質(zhì)或基因組的殘留,；
由圖2可看出,，若泳道上部有明顯的高分子量雜帶,，則可能是有DNA的殘留，不建議用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn),，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成影響（圖2左）,；若在膠孔處有比較亮的著色成分，則是有蛋白質(zhì)的殘留（圖2右）,。
RNA完整性評(píng)估
除了濃度,、純度外，RNA完整性也是判斷RNA質(zhì)量的重要指標(biāo),。RNA完整性一般可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行評(píng)估,。總RNA中占比達(dá)80%以上的是核糖體RNA（rRNA）,，因此,，膠圖呈現(xiàn)的結(jié)果主要是rRNA。
對(duì)于真核生物來(lái)說(shuō),，高質(zhì)量的RNA通常有三條帶,，最亮的是28S，其次是18S,，最淡的是5S,。28S條帶亮度應(yīng)為18S條帶亮度的2倍(圖3左)，若RNA呈現(xiàn)彌散狀,，表明RNA已降解（圖3右）,。
小翌在與小伙伴交流的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，很多實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有跑RNA瓊脂糖凝膠電泳的習(xí)慣,，也不清楚RNA的電泳需注意哪些要點(diǎn),，小翌在此做些科普：
2）緩沖液和瓊脂糖凝膠都需新配制,，采用RNase-free H2O配制電泳緩沖液,；
3）關(guān)于marker的選擇，建議使用RNA marker,；
4）RNA電泳宜使用高電壓短時(shí)間的方法，以防電泳過(guò)程中RNA的降解,。
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【1】Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.
