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Yeasen Hieff Clone® 一步法克隆試劑盒榮登《Cell》《Science》等國(guó)際頂尖期刊

提起“分子克隆"或“載體構(gòu)建"這兩個(gè)詞,，大家可能最先想到的是傳統(tǒng)酶切酶連法,，即用限制性?xún)?nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端，通過(guò)T4 DNA連接酶連接兩個(gè)片段的克隆方法,。該方法存在著一些明顯的局限,，如連接反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣,，克隆效率低,，酶切位點(diǎn)的選擇易受到限制等。

為了提高克隆效率,，節(jié)省反應(yīng)時(shí)間,，基于同源重組酶的無(wú)縫克隆技術(shù)應(yīng)用而生。與傳統(tǒng)酶切酶連技術(shù)相比,，無(wú)縫克隆技術(shù)操作簡(jiǎn)單快速,，不受到酶切位點(diǎn)的限制,，可一次進(jìn)行多個(gè)片段的拼接,，大大的提高了克隆效率。

翌圣生物在成熟的工具酶表達(dá)純化平臺(tái)基礎(chǔ)上,，獲得高純度重組酶,，并反復(fù)優(yōu)化重組酶反應(yīng)微環(huán)境，研發(fā)出Hieff Clone®系列無(wú)縫克隆試劑盒,。

Hieff Clone®克隆試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn),，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線(xiàn)性化,，并在插入片段正,、反向PCR引物5'端引入15-25 bp的線(xiàn)性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5'和3'末端分別帶有與線(xiàn)性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列,。PCR產(chǎn)物和線(xiàn)性化載體在重組酶的作用下,，僅需50℃反應(yīng)15-20 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆,，克隆陽(yáng)性率可達(dá)95%以上,。

? 無(wú)需考慮酶切位點(diǎn)：不受插入片段酶切位點(diǎn)的限制，適用于任何載體,；插入片段兼容粘性或平末端,。

?  設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5'端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

?  快速高效：50℃,，20 min即可完成重組反應(yīng),。克隆陽(yáng)性率可達(dá)95%以上。

?  應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆,，高效克隆50 bp-10 kb片段,；也可結(jié)合Canace高保真酶，應(yīng)用于定點(diǎn)突變,。

?  線(xiàn)性化載體的制備：酶切或PCR制備線(xiàn)性化載體

?  插入片段的制備：在目的DNA片段上下游引物的5'端引入15-25 bp左右載體末端同源序列,；PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段。

?  重組反應(yīng)：按比例混合線(xiàn)性化載體和目的DNA片段進(jìn)行重組,，50℃反應(yīng)15-20 min,。

?  轉(zhuǎn)化、涂板：將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板,，陽(yáng)性克隆鑒定,。

圖1：Hieff Clone®一步法快速定向克隆試劑盒進(jìn)行單片段和多片段克隆實(shí)驗(yàn)流程圖。

? 單片段高效重組

圖2：Hieff Clone® One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長(zhǎng)度的單片段基因,。

A-D：重組轉(zhuǎn)化平板,。E：插入片段和載體濃度檢測(cè)電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖,。箭頭指示目的條帶,。載體：pFastBac1，4.7 kb,，插入片段大小分別是1.2 kb,，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3,，重組反應(yīng)條件：50℃,，20 min。

? 多片段輕松重組

圖3：Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行三片段克隆,。

A：重組轉(zhuǎn)化平板,。B：插入片段和載體濃度檢測(cè)電泳圖。C：PCR方法鑒定每個(gè)單片段和最終連接基因,。箭頭指示目的條帶,。載體：pCAMIBA1302，10 kb,，三個(gè)插入片段長(zhǎng)度：1 kb,，1.5 kb和2.5 kb，重組反應(yīng)條件：50℃,，20 min,。

?  長(zhǎng)片段重組

實(shí)驗(yàn)信息：載體大小：8000 bp,，目的片段大?。?500 bp,。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

圖5：使用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆。

A：陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化平板,。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板,。C：載體和目的片段的濃度檢測(cè)電泳圖。D：菌落PCR鑒定電泳圖,，箭頭指示目的條帶,。 M₁：Marker Ⅲ；M₂：100 bp DNA ladder,。(仁濟(jì)醫(yī)院)

?  多片段重組
實(shí)驗(yàn)信息：載體大?。?/span>3996 bp；四個(gè)片段大?。?76 bp,，867 bp，915 bp和647 bp,。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

圖6：使用Hieff Clone® Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆,。

A：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。B：1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖,。C：菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果,，其中1為原始質(zhì)粒對(duì)照電泳，2-5為重組質(zhì)粒,，僅檢測(cè)863bp的一個(gè)目的片段,，6為假陽(yáng)性,。D：陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果,。M：Marker II。（微生物所)

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Q：Hieff Clone®克隆的原理是什么,？

A：利用末端同源重組的原理,。將任意線(xiàn)性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q：與傳統(tǒng)克隆相比,，Hieff Clone®克隆有什么優(yōu)勢(shì),？

A： 1）無(wú)需考慮酶切位點(diǎn)：不受插入片段酶切位點(diǎn)的限制，適用于任何載體,；插入片段兼容粘性或平末端,。

2）設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5'端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

3）快速高效：50℃,，20 min即可完成重組反應(yīng),。克隆陽(yáng)性率可達(dá)95%以上,。

4）應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆,，也可結(jié)合Canace高保真酶,，應(yīng)用于定點(diǎn)突變。

Q：同源序列長(zhǎng)度對(duì)重組效率的影響,？

A：同源序列的長(zhǎng)度與克隆數(shù)目有相關(guān)性,，一般同源片段選擇在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范圍內(nèi)調(diào)整,。并且選擇盡量避免出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),。

Q：線(xiàn)性化載體和目的片段產(chǎn)物的質(zhì)量會(huì)影響重組反應(yīng)嗎？

A：線(xiàn)性化載體或目的片段品質(zhì)較差時(shí)會(huì)極大影響重組反應(yīng),，建議割膠回收純化產(chǎn)物,。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒對(duì)感受態(tài)細(xì)胞有要求嗎？

A：推薦使用轉(zhuǎn)化效率為10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞,。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES）,，TOP⑩（cat NO. 11801ES）等。

Q：線(xiàn)性化載體和目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量和比例,？

A：載體使用量應(yīng)大于0.01 pmol,，推薦使用量0.03 pmol；克隆載體與目的片段摩爾比應(yīng)在2:1-1:5范圍內(nèi),，最適為1:2-1:3,，超過(guò)范圍可能會(huì)影響克隆效率。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒適用實(shí)驗(yàn)有哪些,？

A：本試劑盒適用于絕大多數(shù)基于常規(guī)“酶切-連接"方法的克隆實(shí)驗(yàn),，并且特別適用于其它常規(guī)方法難以快速實(shí)現(xiàn)的基因多點(diǎn)突變、全基因合成等,。

Q：多片段一步法快速定向克隆試劑盒可以用于單片段的克隆嗎,？

A：多片段一步法克隆試劑盒可以用于單片段的克隆。但是,，單片段克隆試劑盒不建議用于多片段的克隆,，重組效率可能會(huì)受到影響。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒反應(yīng)溫度是50℃,，是否可以在37℃進(jìn)行反應(yīng),？

A：一般情況下建議在50℃進(jìn)行反應(yīng)。50℃有利于消除DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),，同時(shí)是Hieff Clone®重組酶的最適反應(yīng)溫度,。37℃反應(yīng)條件也可以進(jìn)行重組反應(yīng)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行優(yōu)化,。

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HB210723