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前言：免疫療法是目前腫瘤治療領(lǐng)域///具前景的發(fā)展方向之一,，越來越多的研究靶點進(jìn)入CAR-T療法的臨床實驗,。但這類細(xì)胞療法在部分患者中療效短暫,、無法應(yīng)對實體瘤等問題依然困擾著科學(xué)家們。要實現(xiàn)CAR-T細(xì)胞更廣泛的治療應(yīng)用,，就必須在多個層面進(jìn)行設(shè)計和控制,，進(jìn)而提高療效和安全性。
 

一,、什么是CAR-T療法,？
CAR-T(Chimeric antigen receptor T cell)療法：是指通過基因改造技術(shù)，使患者 T 淋巴細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體,，進(jìn)而能特異性識別,、結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原靶點，并同時激活 T 淋巴細(xì)胞使其大量增殖活化,，從而達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的效果,，還可形成免疫記憶T細(xì)胞，從而獲得特異性的抗腫瘤長效機(jī)制,。

CAR-T的結(jié)構(gòu)
CAR的結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū),、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號肽區(qū),。胞外區(qū)主要是抗原特異性單克隆抗體單鏈可變區(qū)序列,，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，二者以鉸鏈連接,。其主要作用是以非MHC（Major histocompatibility complex,，主要組織相容性復(fù)合體）限制性的方式特異性識別靶細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞表面的抗原，向胞內(nèi)傳遞T細(xì)胞活化信號,。鉸鏈區(qū)使得嵌合抗原受體更加靈活,，促進(jìn)抗原受體與腫瘤抗原的結(jié)合；跨膜區(qū)是CD4,、CD8,、CD28等跨膜蛋白分子，起到輔助傳遞T細(xì)胞活化信號的作用,；胞內(nèi)信號肽區(qū)主要是Ｔ細(xì)胞受TCR/CD3ζ 鏈,，負(fù)責(zé)向胞內(nèi)傳遞第—活化信號?；罨?T細(xì)胞大量增殖,，并通過分泌顆粒酶,、穿孔素、IFN-γ 和 TNF-α等細(xì)胞因子直接殺傷靶點腫瘤細(xì)胞,。

（圖源：CAR-T design: Elements and their synergistic function）

二,、CAR-T療法的技術(shù)演變
 

第—代CAR
1989年，以色利化學(xué)家和免疫學(xué)家Zelig Eshhar和他的團(tuán)隊設(shè)計出了第—個 CAR-T細(xì)胞,。第—代的CAR胞內(nèi)只有CD3ζ，在細(xì)胞擴(kuò)增,、體內(nèi)存活時間,、以及細(xì)胞因子分泌等方面能力有限，使用率比較低,，在腫瘤細(xì)胞的治療中的效果并不好,。
 

第二代CAR
2002 年，紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥中心的Michel Sadelain團(tuán)隊,，在CAR結(jié)構(gòu)中引入了CD28共刺激因子,，對提高初始T細(xì)胞獲得持久的體外增殖和較強(qiáng)的細(xì)胞因子分泌起到了很好的效果，在臨床試驗中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問題,，并提高了其作用持久性,。2004年，共刺激因子4-1BB被發(fā)現(xiàn)也能起到激活T細(xì)胞的作用,。第二代CAR在目前的研究中運用///廣泛,。
 

第三代CAR
2012年，研究者們在CAR結(jié)構(gòu)中引入2個共刺激因子,，相比于第二代CAR來說,，第三代CAR在一些前臨床試驗數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出更強(qiáng)更持久的作用活性，但也有報道指出,，三代CAR可能會造成T細(xì)胞刺激閾值的降低,，引起信號泄露，可能誘發(fā)細(xì)胞因子過量釋放,。
 

第四代CAR
四代CAR-T細(xì)胞又被稱為TRUCK T細(xì)胞 ( T-cells redirected for universal cytokine killing ),，其在CAR-T細(xì)胞中引入了一個細(xì)胞因子（主要是IL-12），從而修飾腫瘤微環(huán)境,，募集并活化其他免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng),。

(圖源：AACR)

三、CAＲ-T療法的治療流程
1）細(xì)胞分離：血細(xì)胞分離機(jī)采集腫瘤患者血液中的單個核細(xì)胞（PBMC）,；
2）T細(xì)胞的激活：冷鏈運輸?shù)紾MP標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞實驗室內(nèi)分離并激活PBMC中的T細(xì)胞,；
3）基因修飾：構(gòu)建攜帶CAR的慢病毒載體，轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中,，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增至治療所需劑量,；
4）質(zhì)量檢測：CAR-T細(xì)胞經(jīng)檢測合格后，冷鏈運輸?shù)结t(yī)院通過靜脈回輸至患者體內(nèi)；
5）監(jiān)控：觀察療效并嚴(yán)密監(jiān)測不良反應(yīng),，整個療程持續(xù)3個星期左右,。

(圖源：AACR)

四、影響CAＲ-T臨床療效的因素
雖然CAR-T療法已取得一定進(jìn)步,，但在體內(nèi)增殖,、持續(xù)性、腫瘤識別和殺傷能力,、安全性與克服副作用等方面,，還需要持續(xù)完善。
 

1,、CAＲ的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計
共刺激分子胞內(nèi)區(qū)的嵌入的功能區(qū)會影響CAＲ-T的體內(nèi)活性和持續(xù)性,。研究表明在CAＲ結(jié)構(gòu)中嵌入CD28能顯著改善一代CAＲ-T在B細(xì)胞淋巴瘤患者體內(nèi)的擴(kuò)增和持續(xù)性。目前已有CD28,、CD137,、CD134、ICOS 和DAP10等多種共刺激
分子的胞內(nèi)區(qū)用于二代CAＲ的研究^[1],。

圖A  T細(xì)胞受體的結(jié)構(gòu)：由異源二聚體形式的抗原特異性α和β鏈組成,，α和β鏈與CD3復(fù)合體的ε?δ?γ和ζ鏈緊密相連。T細(xì)胞受體與HLA結(jié)合,。
圖B  CAR：包括與腫瘤抗原結(jié)合的單鏈可變片段（scFv）和細(xì)胞內(nèi)的共刺激結(jié)構(gòu)域,，如CD28和4-1BB以及CD3ζ鏈，它們驅(qū)動信號激活和CAR T細(xì)胞擴(kuò)增,。
（圖源：Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.）
 

2,、載體系統(tǒng)的選擇
CAR的載體系統(tǒng)可以使用質(zhì)粒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等,。應(yīng)用于制備CAR-T細(xì)胞的質(zhì)?；虿《径急仨毥?jīng)過鑒別試驗、復(fù)制型病毒檢測,、無菌試驗,、內(nèi)毒素檢測、支原體檢測,、相關(guān)添加成分的殘留量檢測,、病毒滴度測定以及效力試驗^[2]。
 

不同載體系統(tǒng)的比較^[3]：

五,、CAＲ-T療法的優(yōu)勢和局限性
1,、CAＲ-T療法的優(yōu)勢
1）無MHC限制性
2）可識別的抗原種類多
3）可以在體內(nèi)繼續(xù)增殖
2、CAR-T療法的局限性
1）毒副作用
2）血液腫瘤可能復(fù)發(fā),，實體瘤治療效果差
3）制備費用高,，難以產(chǎn)業(yè)化
 

六、CAR-T療法未來的研究方向
基于CAR-T治療暴露出的局限性,，目前有關(guān)CAR-T的研究和開發(fā),，主要圍繞自///殺開關(guān)，消除標(biāo)記,，藥理抑制和雙分子CAR設(shè)計四個方向來進(jìn)行，旨在降低CAR-T細(xì)胞毒性和提高CAR-T治療的有效性^[4],。

（圖源：Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).）

參考文獻(xiàn)：
[1]Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.
[2]中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會《嵌合抗原受體修飾 T 細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范》
[3]唐曉義, 陳虎, 張斌. 嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞免疫治療的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J]. 解///放///軍醫(yī)藥雜志, 2015, 000(001):12-25.
[4]Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).

 

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