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干貨分享|qPCR復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)不同會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？
王老師：您好，近用你們的試劑跑qPCR,，復(fù)孔平臺(tái)期的熒光信號(hào)不同，這樣的結(jié)果能用嗎,？
小翊：您好,，老師。從圖中來(lái)看,，復(fù)孔重復(fù)性是比較好的，△Ct值<0.5, 這個(gè)結(jié)果沒(méi)什么問(wèn)題的,。
王老師：那為什么復(fù)孔的平臺(tái)期信號(hào)還有相差呢,？有什么方法可以使復(fù)孔熒光信號(hào)一致嗎？
近有不少客戶咨詢小翊類似的問(wèn)題,，擔(dān)心這樣的數(shù)據(jù)不可靠今天小翊就幫您解除疑慮,！
復(fù)孔平臺(tái)期不同不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（△Ct<0.5）
*，理想的PCR擴(kuò)增是使DNA分子由1變2,，2變4,，以2n進(jìn)行擴(kuò)增的。但實(shí)際上,，隨著循環(huán)數(shù)的增加,，體系中的Taq酶、dNTP,、引物等逐漸被消耗并伴隨著副產(chǎn)物的生成,，使得PCR不能呈指數(shù)擴(kuò)增，從而使實(shí)際的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)“S”型,，通常分為基線期,、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期三個(gè)階段,，如圖1。
基線期是指PCR開(kāi)始的3-15個(gè)循環(huán)時(shí)期,，這段時(shí)期擴(kuò)增是存在的,，但因循環(huán)次數(shù)較少，體系中雙鏈DNA積累較少,，熒光信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有超過(guò)熒光本底信號(hào),，此時(shí)的熒光值對(duì)于機(jī)器來(lái)說(shuō)很難準(zhǔn)確檢測(cè)。指數(shù)擴(kuò)增期是指PCR產(chǎn)物的量增長(zhǎng)//快的一個(gè)時(shí)期,，理想條件下,，是呈指數(shù)增長(zhǎng)的，在這個(gè)時(shí)期由于樣品間的細(xì)小誤差尚未放大,，所以復(fù)孔的熒光信號(hào)在這個(gè)時(shí)期相對(duì)一致,。通常熒光閾值需要設(shè)置在此時(shí)期，熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱之為Ct值,，故各復(fù)孔間的Ct值有較好的重復(fù)性（△Ct＜0.5）,。而平臺(tái)期是指由于原料耗盡、反應(yīng)副產(chǎn)物的產(chǎn)生等原因使得擴(kuò)增變得緩慢的一個(gè)時(shí)期,。此時(shí)期經(jīng)過(guò)的循環(huán)次數(shù)較多,，使樣品間的細(xì)小差異被無(wú)限放大，從而導(dǎo)致復(fù)孔間平臺(tái)期的熒光信號(hào)相差很大,。
圖1 擴(kuò)增曲線的三個(gè)階段
下面為大家展示一個(gè)案例,，以293T-cDNA的20倍稀釋液為模板，擴(kuò)增GAPDH基因,，90個(gè)復(fù)孔（如圖2）,。
圖2 同一樣品的90個(gè)重復(fù)的擴(kuò)增曲線圖
由圖可以看出該實(shí)驗(yàn)的復(fù)孔重復(fù)性非常好，△Ct<0.5,，符合MIQE標(biāo)準(zhǔn),。但平臺(tái)期的熒光信號(hào)值均有差異。
綜上：數(shù)據(jù)的有效性和復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)關(guān)系不大,，主要與復(fù)孔間的△Ct有關(guān),，MIQE標(biāo)準(zhǔn)是△Ct＜0.5。
在復(fù)孔△Ct<0.5的情況下,，復(fù)孔平臺(tái)期不同并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，但是有沒(méi)有辦法可以讓復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)盡量一致呢？
使復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)趨于一致的秘訣
1,、確保加樣的準(zhǔn)確性
1）qPCR各組分*化凍需要混勻,。
2）采用預(yù)混的方式進(jìn)行加樣，保證體系的均一性,?？梢詫?/span>除模板以外的試劑進(jìn)行預(yù)混,，分注至各管中。
3）模板濃度高時(shí),，可將模板稀釋,，提高加樣體積，減少加樣誤差,。
2,、確保移液的精///準(zhǔn)度
加樣過(guò)程需確保移液槍未出現(xiàn)漏氣、漏液的情況,，避免使用精///準(zhǔn)度差的移液槍或者不配套的槍頭,。
3、體系混勻并進(jìn)行離心
體系加完后要用移液槍吹打并進(jìn)行離心,，以防試劑掛壁或者體系中有氣泡造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,。
4、qPCR試劑的選擇：選擇“預(yù)混液”形式的qPCR試劑,，反應(yīng)體系只需加入引物和模板,，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)的操作步驟，減少了加樣誤差,。
好了,，讀到這里，您應(yīng)該不會(huì)再用糾結(jié)復(fù)孔平臺(tái)期熒光信號(hào)不同的事了吧,？為了簡(jiǎn)化您的qPCR實(shí)驗(yàn)操作,，讓您的qPCR數(shù)據(jù)更完美，小翊為您推薦一款SYBR Green預(yù)混液：Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat 11184ES）,，該產(chǎn)品是預(yù)混液形式的qPCR試劑,，另外適合于所有的qPCR儀器平臺(tái)（如圖3），兼容快速程序,，可以大大簡(jiǎn)化您的實(shí)驗(yàn)操作并能保證您實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。
圖3. 適合于所有的qPCR儀器平臺(tái)
