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產(chǎn)品信息
 

產(chǎn)品描述
 

Hifair^® T7 High Yield RNA Synthesis Kit進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的優(yōu)化,，試劑盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7 啟動(dòng)子序列的線型雙鏈DNA為模板,，以NTPs為底物,，對(duì)啟動(dòng)子下游的DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，高效合成單鏈RNA,。轉(zhuǎn)錄時(shí)可在底物中加入修飾的核苷酸,，制備生物素或染料標(biāo)記的RNA。

本試劑盒可以合成長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本以及短轉(zhuǎn)錄本,，以1 μg的模板投入量可以產(chǎn)生100-200 μg的RNA,，轉(zhuǎn)錄合成的RNA可用于諸如RNA結(jié)構(gòu)與功能研究、RNA酶保護(hù),、探針雜交,、RNAi、顯微注射及體外翻譯等多方面的下游應(yīng)用,。

產(chǎn)品組分
 

產(chǎn)品應(yīng)用
 

RNA體外合成 

運(yùn)輸儲(chǔ)存方法
 

干冰運(yùn)輸,。-20℃保存，有效期兩年,。

注意事項(xiàng)
 

1. 反應(yīng)體系中須嚴(yán)格注意不要混入RNase,。

2. 實(shí)驗(yàn)器材（如：槍頭、產(chǎn)品管等）注意嚴(yán)格使用 RNase Free用品,。

3. 為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

合成原理

圖1：RNA體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程

操作流程

1.DNA模板制備

帶有雙鏈T7啟動(dòng)子的線性化質(zhì)?；騊CR擴(kuò)增產(chǎn)物都可以作為Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit 體外轉(zhuǎn)錄模板,，模板可以用TE緩沖液或Rnase free H₂O溶解。

T7啟動(dòng)子序列： TAATACGACTCACTATAG^*GG   （注：G*為RNA轉(zhuǎn)錄的第////一個(gè)堿基）

A.質(zhì)粒模板

將目的DNA插入含有T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體中,，然后用限制酶進(jìn)行處理,，待*線性化后進(jìn)行純化。

注：1. 環(huán)狀質(zhì)粒由于沒(méi)有有效的終止,，會(huì)轉(zhuǎn)錄出不同長(zhǎng)度的RNA產(chǎn)物,，為了得到特定長(zhǎng)度的RNA，質(zhì)粒必須*線性化,。

2. 質(zhì)粒線性化所選限制酶需要在啟動(dòng)子區(qū)域右側(cè),、插入DNA////片段的下游，且在插入DNA////片段中無(wú)識(shí)別位點(diǎn),。選擇的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端,。

3. 為了避免蛋白及鹽離子等對(duì)體系的影響，質(zhì)粒線性化后建議純化后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,。

 圖2：線性化質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程

B.PCR產(chǎn)物模板

帶T7啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板,。首先將T7啟動(dòng)子序列(TAATACGA CTCACTATAGGG)加在有義鏈的上游引物的5’端，然后在高保真酶的作用下擴(kuò)增含T7啟動(dòng)子的DNA模板,，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,。PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)純化直接作為模板，但純化后會(huì)得到更高的RNA產(chǎn)出,。

注：1. PCR產(chǎn)物作為模板,，必須電泳確認(rèn)產(chǎn)物的特異性及濃度，建議20μL反應(yīng)體系投入2-5μL PCR產(chǎn)物,。

2. 為了得到更多高品質(zhì)的RNA,，推薦PCR產(chǎn)物膠回收之后再作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

2.RNA體外轉(zhuǎn)錄

A. 試劑解凍

將T7 RNA Polymerase Mix短暫離心,，置于冰上,。解凍10×Transcription Buffer和核糖核苷酸（ATP、CTP,、GTP,、UTP），混勻并離心至管底,，10×Transcription Buffer置于室溫,，4種核糖核苷酸置于冰上，備用,。

B. 室溫裝配轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

按下列體系配制反應(yīng)體系

注： 1. 反應(yīng)于室溫配置,。由于10×Transcription Buffer中含有亞精胺，低溫下亞精胺濃度過(guò)高會(huì)引起DNA模板沉淀,。

2. 短轉(zhuǎn)錄本（<100nt）,，模板可使用2ug，轉(zhuǎn)錄時(shí)間增至4-8個(gè)小時(shí),。

3. 長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（>1000nt）,，建議使用質(zhì)粒線性化模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,。

4. 建議在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，熱蓋打開(kāi),，防止長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致反應(yīng)液蒸發(fā),。

5. 反應(yīng)產(chǎn)物可能有白色沉淀。這是反應(yīng)過(guò)程中游離的焦磷酸與反應(yīng)液中的鎂離子形成焦磷酸鎂,，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn),。如想去除，添加EDTA即可消失,。添加EDTA如果影響后續(xù)實(shí)驗(yàn),，也可以離心回收上清。

6. 使用試劑,、容器等無(wú)RNase污染,。

C. 37℃孵育2個(gè)小時(shí)

將上述反應(yīng)液混合均勻，短暫離心至管底,，37℃孵育2個(gè)小時(shí),。若轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度小于100nt，增加反應(yīng)時(shí)間至4-8個(gè)小時(shí),。

D. DNaseⅠ處理（可選）

反應(yīng)完成后,，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA,。

3.產(chǎn)物純化

轉(zhuǎn)錄后的RNA可以選用RNA Cleaner磁珠進(jìn)行純化（貨號(hào)：12602）,，也可以采用酚/氯坊純化法，氯化鋰沉淀法或柱純化等,，以去除蛋白,、游離的核苷酸。純化后的RNA經(jīng)電泳檢測(cè)后可進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)或存儲(chǔ)于-80℃,。

A.RNA Cleaner磁珠純化法

提前將RNA clean beads從4 ℃取出,，平衡至室溫（約30 min），并用RNase free H₂O將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至50μL,。

①顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻,，吸取2×磁珠（100μL）加入RNA樣品中（50μL），用移液器吹打6次充分混勻,。室溫孵育5 min,，使RNA結(jié)合到磁珠上。

②將樣品置于磁力架上5 min,，待溶液澄清后,，小心移除上清。

③保持樣品置于磁力架上，加入200μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 s,，小心移除上清。重復(fù)此操作一次,。

（注：漂洗時(shí)使用的80%乙醇需要使用RNase free H₂O新鮮配制,，以防止引入RNase酶導(dǎo)致RNA降解。）

④保持樣品始終處于磁力架上,，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠5 min。

（注：磁珠開(kāi)蓋晾干時(shí)要避免過(guò)分干燥,，如果磁珠出現(xiàn)龜裂,，則提示磁珠過(guò)分干燥，此時(shí)RNA的洗脫效率會(huì)降低）,。

⑤將樣品從磁力架上取出,，加入22μL RNase free H₂O，用移液器吹打6次以充分混勻,，室溫靜置5 min,。

⑥將樣品置于磁力架5 min，待溶液澄清后,，小心轉(zhuǎn)移上清20μL至一個(gè)新的RNase free PCR管中,。

（注：建議轉(zhuǎn)移上清時(shí)留2-3μL液體，以免吸到磁珠影響后續(xù)實(shí)驗(yàn),。得到的RNA極不穩(wěn)定,，建議盡快進(jìn)入下一步。若要保存,，請(qǐng)置于-80℃保存,。）

B.酚/氯坊純化法

①向20μL反應(yīng)混合物中，加入115μL RNase free H₂O和l5μL 3M乙酸鈉（pH5.2）,，混合均勻,。

②用等體積的酚/氯坊（1:1）抽提一次，再用等體積的氯坊抽提2次,，收集上清,，并轉(zhuǎn)移至新的RNase free EP管中。

③加入2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀RNA,?；旌暇鶆蚝笾糜?20℃至少30min，以大轉(zhuǎn)速,，4℃離心15min,，收集沉淀。

④加入500μL冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀,。

⑤ 用20μL RNase free H₂O溶解RNA沉淀,。純化后的RNA溶液于-80℃保存,。

C.氯化鋰沉淀法

采用氯化鋰沉淀法，RNA長(zhǎng)度要大于300nt,，且濃度不能低于100ng/μL,。

①向20μL反應(yīng)混合物中，加入30μL RNase free H₂O和30μL7.5M氯化鋰,。

②混合均勻后,，置于-20℃至少30min，以大轉(zhuǎn)速,，4℃離心15min,，收集沉淀。

③加入500μL冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀,。

④ 用20μL RNase free H₂O溶解RNA沉淀,。純化后的RNA溶液于-80℃保存。

D.柱純化法

純化前加入80μL RNase free H₂O將產(chǎn)物稀釋至100μL,，再按柱純化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化,。

4.RNA定量

A.紫外吸收法

游離核苷酸會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性，采用此方法前請(qǐng)先進(jìn)行RNA純化,。然后通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物的A₂₆₀讀數(shù)來(lái)確定RNA的產(chǎn)量,。對(duì)于單鏈RNA，1 A₂₆₀相當(dāng)于40µg/mL,，所以RNA的產(chǎn)量可以如下計(jì)算：  A₂₆₀ x 稀釋倍數(shù) x 40 = µg/mL RNA

B.染料法

用RiboGreen染料進(jìn)行RNA定量,，游離核苷酸不會(huì)影響定量，可以對(duì)純化或未純化的反應(yīng)產(chǎn)物中的RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量,。

5.RNA大小及質(zhì)量檢測(cè)

A.瓊脂糖電泳法

為了確定RNA的大小,，完整度以及質(zhì)量，需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),。

B.Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)法

2100可以用來(lái)評(píng)估RNA完整度及質(zhì)量,，它僅需要少量的RNA進(jìn)行分析，高品質(zhì)的RNA在電圖上應(yīng)呈現(xiàn)明顯且銳利的峰,。

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

1.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)量低

模板的質(zhì)量與產(chǎn)量密切相關(guān),，實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量明顯低于對(duì)照組可能原因有：①實(shí)驗(yàn)?zāi)０逯杏幸种品磻?yīng)成分；②實(shí)驗(yàn)?zāi)０灞旧碓颉?/span>

建議： ①重新純化模板,；②確定模板定量以及其完整性,；③延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；④加大模板投入量,；⑤嘗試其它的啟動(dòng)子和RNA聚合酶,。

2.短轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)量低

轉(zhuǎn)錄起始片段短會(huì)抑制反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小于100nt時(shí)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至4-8小時(shí)或增加模板量至2ug可以提高RNA產(chǎn)量,。

3.RNA轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度大于預(yù)期

如果電泳顯示產(chǎn)物條帶大于預(yù)期大小,，可能原因：①質(zhì)粒模板可能沒(méi)有*線性化；②有義鏈3’端為突出結(jié)構(gòu),；③RNA存在未*變性的二級(jí)結(jié)構(gòu),。

建議：①檢查模板是否*線性化，如有必要,，額外進(jìn)行線性化,；②選擇合適的限制性酶，避免產(chǎn)生3’突出端,，或者用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶補(bǔ)齊后,，再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；③使用變性膠檢測(cè)RNA產(chǎn)物,。

4.RNA轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度小于預(yù)期

如果電泳顯示產(chǎn)物條帶小于預(yù)期大小，可能原因：①模板包含類似于T7 RNA聚合酶的終止序列,；②模板中GC含量高,。

建議：①降低反應(yīng)溫度（比如，30℃）,，有時(shí)降低溫度可以增加轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度,，但會(huì)降低產(chǎn)量?；蛘邍L試不同的RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,；②若模板GC含量高，采用42℃進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng),，或者添加SSB提高產(chǎn)量及轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度,。

5.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳拖尾

電泳過(guò)程中有拖尾現(xiàn)象，可能原因：①實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程被RNase污染,；②DNA模板被RNase污染,。

建議：①實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用RNase-free的槍頭和EP管，佩戴一次性乳膠手套和口////罩,，所有試劑均用RNase free H₂O配制,。②重新純化模板DNA。

HB200916