探秘細胞凋亡過程

                                                       ——實用檢測方法盤點

>>>背景

圖1：細胞凋亡與壞死過程

 
      細胞壞死（necrosis）是因為病理而產(chǎn)生的被動死亡,，如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養(yǎng)不良等均導致細胞壞死,。表現(xiàn)為細胞脹大,、胞膜破裂、細胞內(nèi)容物外溢,、核變化較慢,、DNA降解不充分和引起嚴重的局部炎癥反應等。       
       細胞凋亡與細胞壞死不同,，細胞凋亡（Apoptosis）一般是指機體細胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下通過細胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細胞死亡過程,， 細胞壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。細胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時序性的,，即各事件按先后順序依次發(fā)生,，終導致凋亡小體的出現(xiàn),，細胞隨后發(fā)生凋亡,。細胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細胞群的穩(wěn)定,、機體的防御和免疫反應,、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化,、腫瘤的發(fā)生進展起著重要作用,，并具有潛在的治療意義。

表一：細胞凋亡與細胞死亡的區(qū)別

表二：細胞凋亡的不同檢測方式
 

>>>探秘細胞凋亡，抓重點,、找方法

      細胞處于不同的凋亡階段需要找到不同的特點,，配以合適的檢測工具就能準確解讀細胞凋亡的密碼。凋亡的細胞具有不同的生物學特征,，典型的特征包括：1）細胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）外翻,；2）線粒體膜電位喪失；3）細胞核濃縮和斷裂

>>>凋亡早期檢測

      在正常細胞中,，磷脂酰絲氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于細胞膜內(nèi)側(cè),，但在早期凋亡的細胞中，PS由細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面,，暴露在細胞外環(huán)境中,。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合,，通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合,。將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來,。

圖2：Annexin-V 檢測早期凋亡原理示意圖

>>>線粒體膜電位變化的檢測

       線粒體膜電位（△Ψm ）的丟失導致線粒體膜中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放,，細胞色素C（Cytochrome C）被釋放到細胞漿中，致使Caspase被激活從而誘導細胞凋亡,。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（△Ψm ）的理想熒光探針,，表現(xiàn)出電勢依賴性的積聚在線粒體內(nèi)。正常線粒體內(nèi),，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物,，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光；而在凋亡細胞中,，線粒體跨膜電位去極化,，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低,，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式,。因此顏色的變化將直接反映出線粒體膜電位的變化。

圖3：JC-1檢測熒光與流式結(jié)果示意圖（圖片源自科學網(wǎng)）

>>>凋亡晚期檢測

        細胞凋亡晚期,，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3’-OH末端,，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標記的dUTP結(jié)合到DNA的3’--OH末端，從而可進行凋亡細胞的檢測,，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,，TUNEL）

圖4：TUNEL法檢測原理示意圖

>>>客戶使用數(shù)據(jù)展示
 Annexin-V檢測

(a-2, b-2) 100 μg/ml AuNCs@L-GSH 處理24h，(a-3, b-3) 100 μg/ml AuNCs@D-GSH 處理24h,，(a-1, b-1) 無處理,。

檢測試劑：Cat No. 40302 Annexin-V -FITC/PI檢測流式分析早期凋亡

JC-1檢測

上象限中顯示去極化細胞的百分比；柱狀圖代表正常細胞,，去極化細胞和壞死細胞的平均比例

檢測試劑：Cat No. 40705 JC-1檢測線粒體膜電位改變.

Tunel檢測

小鼠前脂肪細胞3T3-L凋亡檢測,。行代表陰性對照，第二行代表陽性對照

檢測試劑：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

石蠟包埋的腫瘤組織（取自裸鼠）

檢測試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)

>>>已使用客戶發(fā)表文章引用

Annexin V

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JC-1 or JC-10

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TUNEL

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>>>附上小編一些檢測實驗TIP

AnnexinV/PI檢測

Q：Annexin V/ PI 試劑盒能否檢測除人以外其他動物細胞凋亡情況,？
A：可以,。因為Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸（PS）的結(jié)合，而PS不存在種屬間差異,。

Q：使用Annexin V/ PI 試劑盒進行凋亡檢測,，用含EDTA 的胰酶消化細胞對結(jié)果有影響嗎？
A：會,。因為Annexin V 是Ca2+ 依賴的蛋白,，EDTA會 螯合Ca2+從而影響Annexin V與PS 的結(jié)合，進而影響實驗結(jié)果,。

Q：如果細胞自帶GFP蛋白,，請問哪種凋亡檢測試劑盒適用該細胞的凋亡檢測？
A：選用PE標記或者APC標記的Annexin V凋亡檢測試劑,。

Q：對于來自血液的細胞樣品,，為什么去除血液中的血小板？
A：因為血小板中含有PS,，其能與Annexin V結(jié)合進而干擾實驗結(jié)果,。

Q：Annexin -V 在實驗操作上應注意哪些事項？
A：由于Annexin -V染料上帶有熒光基團,，在實驗操作上應盡量避光操作和孵育,；為保證實驗結(jié)果的正確性應在染色后1h內(nèi)上機檢測。

TUNEL檢測

Q：組織切片厚度多少比較合適,？
A：組織切片過厚,，會使得固定效果不理想，*控制在10μm以內(nèi),。

Q：除了Paraformaldehyde固定,，可不可以使用甲醇固定,？
A：使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低,。酸性固定液，也容易導致假陽性的出現(xiàn),。建議采用新鮮配置的4%中性Paraformaldehyde固定液,。

Q：如何避免出現(xiàn)非特異性熒光標記,？
A：（1）對于本身核酶或聚合酶活性水平較高的組織/細胞，例如平滑肌細胞,，建議取細胞或組織后立即固定并且要充分固定,，以阻止這些酶導致假陽性。
      （2）在進行末端標記的時候,，保證細胞或組織表面保持濕潤,，檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
Q：Tunel檢測在實驗操作上有哪些注意事項,？
A：熒光基團長期暴露在普通光照下,，會發(fā)生嚴重淬滅，因此在實驗操作上應盡量避光操作和孵育,。
 

熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)

Q：光補償調(diào)節(jié)的原則,？
A: 1）用于調(diào)節(jié)補償?shù)臉颖颈仨殕稳尽?/span>
2）用來調(diào)節(jié)補償?shù)臒晒馑乇仨毰c實驗用的熒光素一樣（例如不能用FITC調(diào)節(jié)EGFP的補償）。
2）橫平豎直：理論上X-Mean或者Y-Mean要相等（如圖所示）,，但在實際操作中,，只需要保證單染的細胞不跨區(qū)存在。

Q：如何進行光補償?shù)恼{(diào)節(jié),？
A：進行熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié),，需要設置幾組對照實驗。以AnnxinV-FITC/PI雙染試劑盒為例,；
1）空白對照組：不進行任何標記的細胞,，用于電壓的調(diào)節(jié)，調(diào)整前向散射和側(cè)向散射,，得到清晰劃分的細胞群體,。
2）凋亡誘導的單染組：陽性對照的細胞群體需要超過分析的細胞群體的10%，用于調(diào)節(jié)補償,。
3）雙染實驗組：利用空白對照組和單染組調(diào)節(jié)好的參數(shù)進行實驗數(shù)據(jù)的獲得,。

>>>相關產(chǎn)品