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干貨分享|酶切法DNA建庫“十問實(shí)答”,，助您建庫無憂

第二代測(cè)序(NGS)技術(shù)迅猛發(fā)展,，越來越多的科研工作者采用NGS技術(shù)作為課題研究的主要手段,。NGS過程中,，基因文庫的質(zhì)量直接影響后續(xù)的測(cè)序工作，因此構(gòu)建基因文庫是整個(gè)測(cè)序過程中///為關(guān)鍵的步驟,。其中酶切法DNA文庫構(gòu)建,，越來越多的獲得廣大科研人員的青睞。相信在運(yùn)用酶切法構(gòu)建DNA文庫的過程中,，大家或多或少的會(huì)遇到各種問題,。

他山之石，可以攻玉,！接下來小翊帶領(lǐng)大家一起解決實(shí)驗(yàn)開展前后的可能遇到的各種困惑,。

實(shí)驗(yàn)開展前，“千頭萬緒”

1,、DNA文庫構(gòu)建方法的選擇：為什么酶切法建庫如此備受青睞,？

酶切法構(gòu)建DNA文庫，相較于傳統(tǒng)的超聲法和轉(zhuǎn)座酶法具有以下優(yōu)勢(shì)：

• 無偏好片段化酶：具有穩(wěn)定的片段化效果,，無需復(fù)雜的機(jī)械片段化過程,。酶切產(chǎn)物片段大小同樣本類型,、Input DNA量和GC含量等均無相關(guān)性，僅與酶切時(shí)間有關(guān),。
• 建庫流程精簡(jiǎn)：一步完成片段化/末端修復(fù)/加A ,，片段化/末端修復(fù)/加A （30min）-接頭連接（15min）-純化/分選（30min）-文庫擴(kuò)增（15min）-純化分選（30min），常規(guī)建庫預(yù)計(jì)耗時(shí)約2h,，PCR-free建庫預(yù)計(jì)耗時(shí)1h,。
• 寬泛的樣本投入范圍：相比較固定投入量，固定酶切時(shí)間的TN5建庫,，酶切法建庫適用500 pg-1 μg,，滿足個(gè)性化建庫。

圖1.翊圣Onepot系列酶切法建庫優(yōu)勢(shì)

2. 酶切法建庫運(yùn)用的是什么酶,，類似限制性酶切酶嗎,，具體如何打斷DNA呢？

不同于限制性酶切酶,，片段化酶是隨機(jī)內(nèi)切酶,，不受特定酶切位點(diǎn)的限制，隨機(jī)切割對(duì)應(yīng)模板DNA,，片段化的產(chǎn)物屬于粘性末端,，后續(xù)需要進(jìn)行末端修復(fù)。

舉例：投入500 pg-1000 ng的正常人類基因組DNA,，30 ℃ 15min, 可將DNA酶切為150-550 bp左右的長(zhǎng)度,。

3. 酶切法建庫適合哪些應(yīng)用研究嗎，對(duì)樣本具有普適性嗎,？

片段化酶酶切法建庫可適用全基因組測(cè)序（含PCR-free文庫構(gòu)建）,、全外顯子測(cè)序、靶向捕獲測(cè)序,、宏基因組測(cè)序等,。適合樣本類型是gDNA、cDNA和高質(zhì)量的FFPE樣本等,，不適合cfDNA（cfDNA無需打斷）,。

4、酶切法建庫試劑盒針對(duì)哪些樣本建庫效果比較好,？

兼容范圍為500 pg – 1μg Input DNA,。應(yīng)盡可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA?；蚪MDNA和cDNA均可獲得高產(chǎn)高質(zhì)的文庫,。

舉例：

展示為翊圣onepot II系列12204應(yīng)用于cDNA文庫構(gòu)建（ds-cDNA）

背景：客戶得到逆轉(zhuǎn)錄的ds-cDNA，全長(zhǎng)1.1kb左右，想酶切至300 bp左右,。

結(jié)論：Input DNA 50 ng左右,，酶切4-10 min，PCR 8Cycles,，產(chǎn)量>3μg,若需要更集中的文庫,，可進(jìn)行雙輪分選。

5,、對(duì)于不同類型的DNA樣本,，酶切時(shí)間如何控制？

對(duì)于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA,，酶切時(shí)間如下：

當(dāng)然了,，為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，建議在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào),。

實(shí)驗(yàn)開展后,，“五味陳雜”

6、gDNA///片段化參考說明書酶切條件酶切20 min,，竟然切不動(dòng),？

一般優(yōu)先考慮DNA的質(zhì)量問題，比如 Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽離子,，可能會(huì)影響酶切效果，建議將DNA稀釋在ddH₂O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再進(jìn)行片段化,。其次,，如果樣本是反轉(zhuǎn)錄得到的全長(zhǎng)cDNA，則需考慮樣本純度問題,。另外,，對(duì)于環(huán)狀DNA的酶切，需要另行摸索酶切時(shí)間體系,。特殊樣本可考慮磁珠純化之后進(jìn)行酶切或適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間,。

備注：紅色曲線表示，30度酶切20 min未切開

7,、FFPE樣本,，酶切時(shí)間太難控制了？

*,，F(xiàn)FPE樣本雖然使組織得以長(zhǎng)期保存,，但其特殊的制作方法和保存過程對(duì)核酸分子造成多方面的影響：核酸與蛋白交聯(lián)、降解嚴(yán)重等諸多問題,。我們先來看下不同質(zhì)量的FFPE樣本,，采用相同的酶切條件影響有多大。

舉例：相同酶切條件下，質(zhì)量高的樣本酶切效果較好,，滿足需求（樣本4）,，質(zhì)量差的樣本出現(xiàn)過度酶切現(xiàn)象，酶切片段偏?。颖?/span>1/3）

因此對(duì)于不同降解程度的FFPE樣本,，建議做好質(zhì)量控制，對(duì)樣本進(jìn)行分層級(jí),，不同層級(jí)的推薦酶切時(shí)間參考下表,。對(duì)FFPE樣本，建議搭配翊圣FFPE修復(fù)試劑FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606).

備注：FFPE樣本DNA質(zhì)量也可通過瓊脂糖凝膠電泳膠圖簡(jiǎn)單判斷,，高質(zhì)量樣本-DNA質(zhì)量大于10kb,，條帶明亮單一，建議酶切10 min左右,；一般質(zhì)量樣本-膠圖顯示無明顯主帶,，整體彌散條帶，建議酶切6-8 min,；質(zhì)量較差樣本-膠圖無主帶,，整體條帶弱，建議酶切2 min,；極差FFPE樣本,，建議可不酶切，搭配FFPE修復(fù)試劑直接建庫,。

8,、DNA酶切后出現(xiàn)大片段殘留？

酶切產(chǎn)物出現(xiàn)大片段殘留現(xiàn)象,，考慮Input DNA純度外（參考FAQ 6）,，建議適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間。

9,、酶切時(shí)間也不長(zhǎng),，竟然過度酶切了?

以插入片段300 bp為例，白細(xì)胞gDNA,，30 度酶切10min,，出現(xiàn)如下圖過度酶切現(xiàn)象。建議參考酶切條件需要考慮不同樣本gDNA大小,，如白細(xì)胞gDNA較小,，應(yīng)適當(dāng)縮短酶切時(shí)間，否則易出現(xiàn)如下過度酶切現(xiàn)象,。

10,、酶切法建庫,，如何做到較好的質(zhì)量控制？

1）文庫濃度檢測(cè),，qubit法或qPCR ,；

2）文庫長(zhǎng)度檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定,；

3）文庫質(zhì)量鑒定,，Agilent 2100/2200；

4）文庫大小分布,、引物二聚體和過擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失,，應(yīng)通過電泳方法進(jìn)行確認(rèn).

構(gòu)建優(yōu)異的DNA文庫，除了明確以上因素之外,，還需要選擇高質(zhì)量的建庫產(chǎn)品,。翊圣生物為滿足廣大科研工作者的NGS建庫實(shí)驗(yàn)需求，推出了NGS建庫整體解決方案,，方便大家根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇,。