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Clodronate Liposomes體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除利器-高效,、迅捷、持久
——高效,、迅捷,、持久
去除巨噬細(xì)胞（depletion of macrophages）是研究巨噬細(xì)胞功能的重要方法。荷蘭阿姆斯特丹Vrije University 的Nico van Rooijen教授開發(fā)的一款Clodronate Liposomes,，可以利用巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制,，將膜不通透性的氯磷酸（clodronate）帶入細(xì)胞內(nèi)，氯磷酸被釋放,，當(dāng)達(dá)到一定的濃度時(shí)可引發(fā)巨噬細(xì)胞的凋亡,，從而達(dá)到去除巨噬細(xì)胞的目的。
作用原理
兩親性磷脂分子在水中可以形成同心圓形式的磷脂雙分子層球體,，磷脂雙分子層中間通過水相分隔,。溶解在水溶液中的氯磷酸鹽在形成脂質(zhì)體的過程中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中（如圖1）。游離的氯磷酸鹽不能自由的通過脂質(zhì)體的磷脂雙分子層,。隨著脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞吞噬,，在巨噬細(xì)胞溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質(zhì)體水相中的氯磷酸鹽就可以被逐步釋放出來,，并累積在細(xì)胞內(nèi),，當(dāng)其達(dá)到一定濃度時(shí)，巨噬細(xì)胞將會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷,，從而進(jìn)入凋亡過程（如圖2）,。從死亡的巨噬細(xì)胞中釋放出來的氯磷酸鹽在細(xì)胞外的半衰期極短（大約15 min），可以通過泌尿系統(tǒng)排除體外,。
圖1：氯磷酸-脂質(zhì)體（Clodronate liposomes）復(fù)合物
圖2：巨噬細(xì)胞清除原理示意圖
產(chǎn)品性質(zhì)
1mL脂質(zhì)體體懸液中所含的氯磷酸大約為5 mg,。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4,，140 mM NaCl,。
體內(nèi)注射方案（僅供參考）
隔日尾靜脈注射200 μL clodronate liposome，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制定注射日程,，通過免疫組化或流式檢測巨噬細(xì)胞去除效率,。
尾靜脈注射方法流程：
（1）將小鼠放在倒扣的飯盒內(nèi),，從孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動(dòng)脈和3條靜脈,，2條動(dòng)脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面,，3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩側(cè)的靜脈,；
（2）將紗布浸泡于約70℃溫水中,，拿出后包裹尾巴，以達(dá)到使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的,；
（3）行尾部靜脈注射時(shí),，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2 cm一段,，使皮膚緊張,，靜脈更為充盈，右手持1 mL針頭注射器,，使針頭與靜脈平行(小于30°角),，從尾巴的下1/4處進(jìn)針，開始注入藥物時(shí)應(yīng)緩慢,，仔細(xì)觀察,，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn),，說明已刺入血管,，可正式注入藥物。
（4）有的實(shí)驗(yàn)需連日反復(fù)尾靜脈注射給藥,，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始,，按次序向尾根部移動(dòng)，更換血管位置注射給藥,。拔出針頭后,，用棉球按住注射部位輕壓1-2 min，止血,。
注：以上操作方法和劑量使用僅供參考,，不同的實(shí)驗(yàn)要求需自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案或是參考相關(guān)文獻(xiàn)。
靜脈注射效果參考示意圖
圖3：靜脈注射效果圖
效果展示
參考案例一：
圖4：左圖是正常小鼠肝臟免疫細(xì)胞中Kupffer細(xì)胞的比例,，右圖是注射Clodronate Liposomes 48小時(shí)后Kupffer細(xì)胞的比例,，可以看到Kupffer細(xì)胞基本被清除[1]。
參考案例二：
圖5：上圖是小鼠LLC細(xì)胞肺癌成瘤實(shí)驗(yàn)中正常腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞（紅色熒光）,，下圖是氣管灌注Clodronate Liposomes腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞（紅色熒光）,，可以看出腫瘤中的巨噬細(xì)胞基本被清除[2]。
FAQ
Q1:收到Clodronate liposomes后該如何操作,？
A:收到氯磷酸脂質(zhì)體后,，如果不能馬上使用,，需要放置在4℃冰箱。禁止凍存,！使用時(shí)作為原液使用,，不能進(jìn)行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀,，建議使用之前輕輕混勻，另外4℃的氯磷酸脂質(zhì)體不能馬上使用,，需要恢復(fù)到室溫才能進(jìn)行注射,。
Q2:如何將脂質(zhì)體從小瓶中轉(zhuǎn)移出來？
A:從小瓶中轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體的最佳方法是使用無菌針頭注射器,。這樣小瓶中剩余的脂質(zhì)體懸浮液就可以保持密封和清潔,。您也可以使用帶有無菌吸頭的移液器進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但潔凈的環(huán)境中進(jìn)行,，例如在BSC罩中,。
Q3: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細(xì)胞清除？
A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細(xì)胞的清除,，但是這種方法比較適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn),。主要是由于在體外培養(yǎng)過程中，從死亡細(xì)胞釋放的氯磷酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏"出來氯磷酸,，會(huì)一直存在于培養(yǎng)基中,，但是在體內(nèi)，氯磷酸的半衰期很短,，很快就會(huì)被腎臟清除,。雖然游離的氯磷酸不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞也不會(huì)進(jìn)入脂質(zhì)體，但是一旦他們?cè)谂囵B(yǎng)基中積累就會(huì)慢慢地進(jìn)入細(xì)胞中,。
Q4:在靜脈注射Clodronate liposomes后動(dòng)物很快就死亡了,，是什么原因？
A:一方面有可能是動(dòng)物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液,。建議在使用之前輕輕搖晃混勻,。脂質(zhì)體在體外一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生沉降。如果在很長一段時(shí)間內(nèi)需要一次注射多只動(dòng)物,，那么脂質(zhì)體便會(huì)在注射器中發(fā)生沉淀,，形成不均一懸液，這樣一來,，第一只注射的計(jì)量與最后一只注射的計(jì)量就會(huì)發(fā)生明顯的變化,。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后，沒有恢復(fù)到室溫,。
Q5:動(dòng)物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了,？
A：這個(gè)可能是受到細(xì)菌的污染,，體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞后會(huì)增加例如病毒粒子，細(xì)菌或者酵母感染的幾率,。
Q6:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細(xì)胞并沒有*消失,？
A：大鼠中成熟的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)ED1和ED2雙陽性，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細(xì)胞也是ED1+,，但是呈現(xiàn)ED2-,。因此，所有ED2+的細(xì)胞都可以被*清除,，但是ED1+的細(xì)胞卻只能被部分清除,，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細(xì)胞的比例。
Q7: Clodronate liposomes沒有達(dá)到期望的效果,？
A：氯磷酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn),，每批次都會(huì)對(duì)氯磷酸的濃度以及一些可能的污染物進(jìn)行檢測，確保無誤后才會(huì)銷售給客戶,。另外,，脂質(zhì)體容易收到溫度的影響。正確的運(yùn)輸和儲(chǔ)存方式是4~8℃,，懸液既不能被凍存,，也不能被加熱超過30℃。自收到貨物起,，需要在3個(gè)月內(nèi)使用完,，不然有可能會(huì)影響使用的效果,。
Q8:在靜脈注射時(shí),，能不能增加注射的體積？
A：靜脈注射時(shí)需要依據(jù)動(dòng)物的體重,，不能超過0.1 mL/10 mg,，但是進(jìn)行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點(diǎn)的容量進(jìn)行決定,。
Q9:使用脂質(zhì)體應(yīng)注意的一些事項(xiàng)？
A：通過具有飽和烴鏈的脂質(zhì)制備而來的脂質(zhì)體實(shí)際上非常堅(jiān)固,，但仍需要注意以下一些事項(xiàng)。
①不要與有機(jī)溶劑混合,，如氯仿,、甲醇,、乙醇、DMSO等,。
②不要添加表面活性劑，除非您必須要這樣做以裂解脂質(zhì)體,。
③不要加熱,、接近或高于脂質(zhì)主相轉(zhuǎn)變溫度，除非進(jìn)行藥物加載,，這需要在相變溫度以上進(jìn)行孵育,。
產(chǎn)品訂購
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
Clodronate Liposomes（From Vrije Universiteit Amsterdam） 體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑 | 40337ES05/10 | 2 mL/10 mL | 1856/4376 |
Control Liposomes（PBS）體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑空白脂質(zhì)體對(duì)照 | 40338ES05/10 | 2 mL/10 mL | 986/1956 |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit 蘇木素伊紅（H&E）染色試劑盒 | 60524ES60 | 2×10 mL | 358 |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red 胰酶-EDTA溶液（0.25%）,，含酚紅 | 40127ES60 | 100 mL | 88 |
Fetal Bovine Serum Origin South America Gold 胎牛血清（南美特級(jí)） | 40130ES76 | 500 mL | 2458（促） |
【注】40338體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑空白脂質(zhì)體對(duì)照是相對(duì)于40337體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除劑而言的,，僅在制備的過程中沒有添加氯磷酸的成分,，是實(shí)驗(yàn)過程中陰性對(duì)照,。
參考文獻(xiàn)
[1]: Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.
[2]: Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.
