日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

RT-qPCR需要注意的那些事,，你都了解嗎,？

在RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中不論是實(shí)驗(yàn)小白,，都會遇到各種不同的實(shí)驗(yàn)問題,。解決問題不僅要浪費(fèi)額外的樣品和試劑,，還要占用大量的時間一遍遍的重復(fù)和分析,，真是被實(shí)驗(yàn)折磨得焦頭爛額。那實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該注意哪些細(xì)節(jié)呢,？小翊精心為大家總結(jié)了RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng),，希望助小伙伴們一臂之力。

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)包括RNA提取與質(zhì)量評估,，逆轉(zhuǎn)錄和qPCR三大步驟,，每個步驟都有很多注意事項(xiàng),，才能做出可靠的數(shù)據(jù)。下面由小翊給您詳細(xì)介紹,。

RNA質(zhì)量評估

在RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中,，RNA提取完成后，需要對RNA的質(zhì)量進(jìn)行評估,，合格后才可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),。評估方法有分光光度計，瓊脂糖凝膠電泳,，Agilent 2100分析等,，其中常用的有分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測。我們需要注意的是這兩種方法需要搭配使用,，才能完成對RNA濃度,、純度和完整度的檢測分析，以保證RNA的質(zhì)量,。

分光光度計檢測法

分光光度計主要用于測定RNA的濃度和純度，但不能對RNA的完整度和基因組殘留進(jìn)行檢測,。其中,，A260/280和A260/230是RNA純度檢測的重要參數(shù)，可根據(jù)其數(shù)值的波動,，檢測RNA的純度：

2 1.9< A260/280< 2.1,，說明RNA純度較好；A260/280<1.9,，表示RNA中可能有蛋白殘留,；A260/280>2.1，表示RNA可能有部分降解,，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn),。

2 2.0< A260/230< 2.2，說明RNA純度較好,；A260/230< 2.0,，則說明RNA中可能有機(jī)試劑殘留，如酚,、乙醇或糖類等,。

瓊脂糖凝膠電泳檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分析RNA的完整度，基因組和蛋白殘留,，但不能對RNA的濃度準(zhǔn)確定量,，也不能檢測有機(jī)試劑的殘留。以真核生物RNA模板為例：

2 將RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，若膠圖上只有28sRNA,、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶,，說明提取的RNA完整度良好。如果出現(xiàn)拖帶的現(xiàn)象,，表示RNA部分降解,。

2 若膠孔和28sRNA條帶之間出現(xiàn)單一明亮的條帶，表示可能有基因組DNA殘留,。

2 若膠孔內(nèi)出現(xiàn)條帶,，說明可能有蛋白等大分子物質(zhì)殘留。

逆轉(zhuǎn)錄

RNA提取完成后,，需要反轉(zhuǎn)成cDNA才能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),，所以反轉(zhuǎn)步驟是*的。逆轉(zhuǎn)錄將從逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇和引物的選擇進(jìn)行介紹：

逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇

常見代表性反轉(zhuǎn)錄酶有AMV RTase和MMLV RTase兩大類：AMV RTase的RNase H活性強(qiáng),，合成長度短,，合成量低，熱穩(wěn)定性好（42～55℃）,；MMLV RTase的RNase H活性弱,，合成長度長，合成量高,，熱穩(wěn)定性差（37～42℃）,。

由于RNase H酶具有降解RNA模板的功能，所以在逆轉(zhuǎn)錄時應(yīng)該優(yōu)先選擇RNase H活性弱的MMLV ,，而且后期經(jīng)過基因工程改造,，MMLV熱穩(wěn)定性已達(dá)到質(zhì)的飛躍。以Yeasen的Hifair® Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶（11141）為例,，該酶經(jīng)基因工程改造,，刪除了RNase H活性，同時反應(yīng)溫度可達(dá)60℃,，針對高GC及富含復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板具有更高的反轉(zhuǎn)錄效率,。

引物的選擇

通常RT primer可分為三類：oligo dT，隨機(jī)引物和基因特異性引物,。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選擇適合的引物進(jìn)行使用,。

2 如果模板為真核生物來源，且后期cDNA用于常規(guī)PCR擴(kuò)增,，建議選擇Oligo（dT）,；若后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅用于qPCR，建議將Oligo（dT）與隨機(jī)引物混合后使用,，可提高反轉(zhuǎn)錄效率,。

2 如果模板為原核生物來源，反轉(zhuǎn)錄請選用Random Primers 或者基因特異性引物。

熒光定量

熒光定量主要從定量方法的選擇,、引物設(shè)計原則,、ROX的選擇、反應(yīng)體系的配置和反應(yīng)條件的設(shè)置等分別進(jìn)行闡述：

定量方法的選擇

定量方法分為相對定量和定量,。相對定量可用于檢測某種處理方法對基因表達(dá)的影響,，檢測基因在不同時間的表達(dá)差異和比較基因在不同組織中的表達(dá)差異；定量可對病毒中核酸的量進(jìn)行檢測等,。大家在做實(shí)驗(yàn)時,，一定要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)選擇合適的定量方法。

引物設(shè)計原則

qPCR引物設(shè)計的好壞,，直接關(guān)乎著擴(kuò)增效率高低,，產(chǎn)物特異性與否。所以正確設(shè)計出好的引物是qPCR成功的第—步,。引物設(shè)計在滿足常規(guī)引物設(shè)計的原則上還要注意以下原則：

2 目的片段長度控制在100 ~ 300 bp,；

2 跨外顯子設(shè)計，避免基因組DNA的影響,；

2 設(shè)計的引物需要進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測,，擴(kuò)增效率達(dá)標(biāo)（90-110%）才可用于定量實(shí)驗(yàn)；

2 引物濃度通常在0.1uM-1.0uM之間優(yōu)化選擇,。

ROX的選擇

在定量反應(yīng)過程中,，ROX能夠均一化校正儀器的光程差，移液誤差或蒸發(fā)冷凝導(dǎo)致的體積差等,，提高結(jié)果的重復(fù)性。但需要注意的是ROX的選擇與儀器相關(guān),，如果qPCR儀有自動校正孔間差的功能,，就不需要添加ROX，反之則需要添加ROX校正,。小伙伴們在買試劑時一定要根據(jù)所用的儀器型號選擇正確ROX,，避免后期出錯。

反應(yīng)體系的配制

反應(yīng)體積優(yōu)先推薦20ul和50ul,。體系配制時要注意以下事項(xiàng)：

2 反應(yīng)體系需要在超凈工作臺中通風(fēng)配制,；每次實(shí)驗(yàn)都要用新的ddH₂O；

2 每次實(shí)驗(yàn)都需要配制NTC來驗(yàn)證體系中是否存在污染,，配制體系時每一對引物都需要做NTC,；

2 如果想檢測RNA模板是否有g(shù)DNA殘留，可將每個樣本都配制NRT進(jìn)行檢測,；

2 配制體系時,，一個樣本建議至少做3個技術(shù)型重復(fù)；

2 模板為cDNA時,，建議稀釋5-10倍,，減少反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR實(shí)驗(yàn)的抑制作用,，模板量進(jìn)行梯度摸索，使CT值落在20-30之間///佳,；

2 確定所需的反應(yīng)數(shù)量,，在反應(yīng)數(shù)量的基礎(chǔ)上增加5-10%，計算體積配置數(shù)量,；

2 體系配制采用能預(yù)混則預(yù)混原則,，混勻后離心并保證無氣泡；

2 盡量選擇進(jìn)口且配套的耗材,，如ABI儀器使用ABI封板膜,，伯樂儀器使用配套的白色陶瓷板子。

反應(yīng)條件的設(shè)定

不同的熒光定量酶可能反應(yīng)條件不一樣,。比如Yeasen的熒光定量酶就分為配體法熱啟動酶和抗體法熱啟動酶,，關(guān)于這兩種酶反應(yīng)條件的設(shè)定需要注意以下幾點(diǎn)：

2 設(shè)置程序時要注意配體法的預(yù)變性為95℃，5min,；抗體法的預(yù)變性為95℃,，30s。,；

2 選擇兩步法,，可保證產(chǎn)物高特異，選擇三步法可保證率擴(kuò)增,，小伙伴可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)選擇合適的程序,。

2 上機(jī)時盡量避免使用外面一圈的孔。

以上就是小翊對RT-qPCR注意事項(xiàng)的詳細(xì)總結(jié),，希望能夠?qū)Υ蠹业膶?shí)驗(yàn)有所幫助,。小翊在這里提前祝大家中秋快樂，實(shí)驗(yàn)順利,。

相關(guān)推薦：