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D-熒光素

原理

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應(yīng)用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是體內(nèi)活體成像技術(shù),。其作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下,，熒光素（底物）能夠被氧化發(fā)光,。當(dāng)熒光素過量時(shí),，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見下圖）。

將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后,，導(dǎo)入研究動(dòng)物如大,、小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素,，通過生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來檢測(cè)光強(qiáng)度變化,，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響,，根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化來指示能量或生命體征,。

分類

使用方法

（1）體外實(shí)驗(yàn)：

a：儲(chǔ)存液配置：將1 g的熒光素鈉鹽或鉀鹽溶解于33.3 ml水中,，制備成30 mg/ml的儲(chǔ)存液?；靹?，0.2μm濾膜過濾（可吹入惰性氣體，如氮?dú)?，以防止氧化,。?/span>-80℃避光保存，一年內(nèi)有效,。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍,，可短暫溫浴，并輕柔混勻）,。②用培養(yǎng)基以1:200的比例稀釋儲(chǔ)存液為150μg/ml,。③去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無殘留。④待圖像分析前,，向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液,，然后進(jìn)行圖像分析（或者細(xì)胞放在37℃短時(shí)間孵育約5min后檢測(cè)可增強(qiáng)信號(hào)）

（2）活體成像：

a：工作液配置：①溶解1 g熒光素鉀鹽或鈉鹽于66.6 ml 無Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS中，配置成15 mg/ml的溶液,。②混勻,，0.2μm濾膜過濾（可吹入惰性氣體，如氮?dú)?，以防止氧化,。?/span>-80℃避光保存,，一年內(nèi)有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍,，可短暫溫浴,，并輕柔混勻）。

②按照動(dòng)物體重150 mg/kg進(jìn)行注射,，（例如,，20 g重的小鼠需要注射200μl ）

③注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號(hào)達(dá)到///強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期）,，再進(jìn)行成像分析,。

注：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定///高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期,。

注射方法

（1）腹腔注射：

將底物注射入腹腔中,。推薦劑量為150 mg/Kg（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）,。使用25 G的針頭,，1 ml注射器。

其方法如下示意圖：

進(jìn)針5 mm,，斜向上30^°角,。

（2）靜脈注射：

小鼠的靜脈注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶靜脈注射。靜脈注射的推薦劑量同腹腔注射,，150 mg/Kg,。注射液體的大體積不可超過血容量的10%。一般對(duì)于20 g 小鼠其血容量為2 ml,，故其大注射量應(yīng)為200μl,。使用1 ml注射器26 G針頭，或者使用胰島素注射器28 G針頭,，確保注射器中無氣泡,。注射前將動(dòng)物置于加熱燈下約5 min，或者將尾巴浸泡于溫水中以擴(kuò)張血管,。操作時(shí)將小鼠固定于鼠筒或者燒杯中,，乙醇消毒尾部，緩慢注射,。

客戶實(shí)例

TIPE2抗炎因子在乳腺癌動(dòng)物模型中的抗腫瘤治療作用

選自文獻(xiàn)：Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 熒光素的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)有成影響嗎,？

A：有影響。99%以上的純度較好,。

Q2: 甲蟲熒光素和螢火蟲熒光素之間有區(qū)別嗎,？

A：二者之間沒有區(qū)別。

Q3: 如何溶解熒光素,，其溶液穩(wěn)定嗎,？

A：熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml，熒光素鈉鹽溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的,，但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml,，在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

熒光素鈉鹽和鉀鹽的水溶液短期內(nèi)存放于-80℃,，對(duì)實(shí)驗(yàn)效果沒有明顯影響,。有實(shí)驗(yàn)證明，將熒光素溶解于脫氧中的水中會(huì)更穩(wěn)定些,。

對(duì)于一些較為敏感的試驗(yàn),，為了控制試驗(yàn)中的可變因素，較推薦新鮮配置的反應(yīng)液 ,。例如,，低濃度的熒光素酶或者并非適的反應(yīng)條件是需要高質(zhì)量的底物才能進(jìn)行反應(yīng) 。

Q4: 熒光素鈉鹽和熒光素鉀鹽有什么區(qū)別,？

A：目前的研究沒有發(fā)現(xiàn)二者在使用效果上的區(qū)別,，僅在物理特征上有些小的差別，如熒光素鈉鹽溶解度會(huì)高于熒光素鉀鹽,。但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中,，有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽，據(jù)不*統(tǒng)計(jì),，選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍,。

Q5: 熒光素鈉鹽，熒光素鉀鹽,，和熒光素游離酸之間有什么區(qū)別,？

A：游離酸不溶于水，在甲醇中的溶解度為10 mg/ml,，在DMSO中溶解度為50 mg/ml,，同樣可用NaOH，KOH弱堿去調(diào)節(jié)溶液的PH值,。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過程中會(huì)更方便,，尤其是在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中，因其能夠溶解在水中,，反應(yīng)毒性也會(huì)更小些,。

Q6: 為什么溶解熒光素鈉鹽或者鉀鹽的時(shí)候需用不含Ca²⁺或Mg²⁺離子的PBS，有無別的鹽溶液可用來溶解熒光素,？

A：PBS,，或者其他的磷酸鹽緩沖液，或DPBS,，常用來進(jìn)行生物學(xué)研究或者細(xì)胞相關(guān)研究,。PBS/DPBS為等滲溶液,，PH為7.2-7.6之間。DPBS和PBS之間無差別,，只是通常情況下,，DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會(huì)抑制某些蛋白酶的活性,。此外Mg²⁺是催化熒光氧化的重要因素,，Ca²⁺是和腔腸素氧化有關(guān)的離子。其他的鹽溶液也可用來溶解熒光素,，但要避免溶液中的陽離對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響,。

Q7: 熒光素酶的發(fā)光特性？

A：熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后,，能夠表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光,，10 min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的///高點(diǎn),，在//高點(diǎn)持續(xù)約20-30 min后開始衰減,，約3 h后熒光素排除，發(fā)光全部消失,，///好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15-35 min內(nèi),。其動(dòng)力學(xué)曲線如下圖：

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內(nèi)，注射方法之間的區(qū)別是什么,？

A：熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi),。約1 min可擴(kuò)散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg,。對(duì)于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可,。對(duì)于腹腔注射來講，擴(kuò)散較慢,，開始發(fā)光較慢,，持續(xù)發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)于熒光素的尾部靜脈注射,，擴(kuò)散快,，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間較短,。

Q9: 熒光素底物可以透過血腦屏障嗎,？

A：熒光素底物約280道爾頓，熒光素的水溶性和脂溶性都非常好,，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障,。

Q10: 熒光素酶的表達(dá)穩(wěn)定性如何？

A：通過穩(wěn)定篩選等過程,，熒光素酶基因是能夠插到細(xì)胞染色體內(nèi)的,。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂,、轉(zhuǎn)移、分化時(shí),，熒光素酶也得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá),，熒光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細(xì)胞才能持續(xù)表達(dá)熒光素酶,。

產(chǎn)品信息