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干貨分享|熱啟動酶耐熱機(jī)制全面解析
常規(guī)PCR技術(shù)因能夠快速擴(kuò)增任何已知的DNA///片段而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域,。但常規(guī)型PCR技術(shù)容易出現(xiàn)引物二聚體或錯配引起的非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象,，造成實驗結(jié)果的不準(zhǔn)確性,。熱啟動型PCR能夠很好的解決上述問題，是常用的提高PCR特異性的方法,。
熱啟動酶介紹
熱啟動酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性,，加熱至變性溫度時修飾物失活，釋放酶活,，從而使PCR反應(yīng)得以正常進(jìn)行,。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學(xué)修飾、配體修飾和抗體修飾等,，不同的熱啟動修飾方法原理上有所區(qū)別,，各有優(yōu)劣勢。
化學(xué)法
DNA聚合酶的化學(xué)法修飾,，一般采用化學(xué)小分子如酸酐等有機(jī)物與聚合酶上的側(cè)鏈氨基酸（賴氨酸）通過化學(xué)反應(yīng)相互作用,，使酶低溫時失去酶活，溫度升高后,，酸酐與氨基之間的化學(xué)鍵斷裂,，酶活釋放，從而達(dá)到熱啟動效果,。化學(xué)修飾可有效封閉酶的活性,，操作簡單，但酶活性釋放速度較慢,，依賴溫度激活DNA聚合酶,，能有效抑制非特異性產(chǎn)物，可在室溫下配置反應(yīng)體系，且對PCR反應(yīng)buffer要求較高,。
圖1：化學(xué)法修飾熱啟動酶原理圖
配體法
配體法修飾,，主要借助核酸適配體封閉酶活。顧名思義,，核酸適配體一般指一類具有特異性識別功能的單鏈核酸分子,，可以是RNA也可以是DNA，長度一般為25～60個核苷酸,。作為一種寡核甘酸序列的識別分子,，作用的靶分子范圍廣泛，從無機(jī)金屬的小分子到生物領(lǐng)域的大分子,。這些適配子可以形成特定的空間構(gòu)象,，從而在表觀功能上與抗體類似。對蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)具有高度特異性,、親和力,。核酸適配體通過非共價鍵與DNA聚合酶結(jié)合，進(jìn)而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應(yīng),。一般核酸適配體的篩選所需周期較短,，整個過程能夠依賴自動化，簡便快捷,。
圖2：配體法修飾熱啟動酶原理圖
抗體法
抗體法熱啟動酶一般考慮使用DNA聚合酶抗體封閉酶活性,，使其在低溫時處于無活性狀態(tài)，在加熱至變性溫度時抗體變性,，解除封閉從而釋放活性,，可以大大避免錯配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。另一方面針對低豐度基因,，封閉抗體在避免預(yù)變性前的DNA聚合酶和模板的非特異性結(jié)合的同時,，增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而保證低豐度基因的有效檢出,，大大提升反應(yīng)靈敏度和擴(kuò)增效率,。
圖3：抗體法修飾熱啟動酶原理圖
表1：熱啟動酶常見修飾方法優(yōu)劣勢比較
酶活封閉類型 | 化學(xué)修飾 | 配體修飾 | 抗體修飾 |
原理 | 化學(xué)小分子和DNA聚合酶活性中心結(jié)合封閉酶活 | 核酸適配體通過非共價鍵作用與聚合酶結(jié)合封閉酶活 | DNA聚合酶抗體與聚合酶結(jié)合封閉酶活 |
酶活釋放條件 | 溫度：大于95 ℃ 時間：10-15 min | 溫度：大于60 ℃ 時間：1-5 min | 溫度：大于70 ℃ 時間：30 s-5 min |
優(yōu)點 | 酶活性維持更加穩(wěn)定且無任何外源DNA污染，性價比較高,。 | 不需要激活步驟，穩(wěn)定性高,，減少樣品降解的可能性,。 | 酶激活時間短，保證酶活,，親和力強(qiáng),，靈敏度高。 |
缺點 | 酶激活時間較長可能會影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低,。 | 核酸配體是一種可逆抑制劑,，不如化學(xué)修飾法穩(wěn)定，特異不夠強(qiáng),。 | 抗體修飾是一種動態(tài)平衡,，抗體生產(chǎn)成本高，試劑配比優(yōu)化時間長,。 |
以上簡單介紹了熱啟動酶的常見類別和各種熱啟動方法的優(yōu)劣勢,，其中化學(xué)修飾物不能夠批量合成，而且需要較長的激活時間聚合酶才能釋放酶活,。配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好,，到40°C時，聚合酶的活性就被釋放出來,，特異性不好,；而抗體法修飾熱啟動酶對應(yīng)的封閉效果佳，酶活釋放速度快,，從而大大降低PCR反應(yīng)時間,，是目前IVD市場上應(yīng)用較多的一種熱啟動酶改造方法。
熱啟動酶應(yīng)用
熱啟動酶在熱啟動PCR的應(yīng)用方面較為廣泛,，不僅有效防止非特異性PCR產(chǎn)物,，而且在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如單拷貝基因的擴(kuò)增、多重PCR和超長片段的擴(kuò)增等應(yīng)用尤為突出,，大大改觀了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的局限性,。在病原微生物檢測、遺傳病診斷和法醫(yī)鑒定等各個領(lǐng)域等實際應(yīng)用中頗為廣泛,。在應(yīng)對爆發(fā)的新guan疫情方面,，熱啟動酶亦貢獻(xiàn)頗多。目前市面上應(yīng)用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR檢測試劑的核心酶基本都是抗體法熱啟動酶,。
相關(guān)產(chǎn)品
類型 | 名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格(元） | 優(yōu)惠價（元） |
抗體法熱啟動酶 | Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA polymerase | 13086ES60/76/90 | 100 U/500 U/ 5000 U | 詢價 | |
Hieff Unicon® Hotstart D-Taq DNA Polymerase | 10715ES01/03/25/60 | 100µl/1mL/25mL/ 100mL | 1652/13252/127852/887652 | / | |
封閉抗體 | Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq酶單克隆抗體 | 31301ES60/80/90/92/93/94 | 100 µg/1/5/10/100/1000 mg | 1153/3653/14653/26353/231753/1969552 | / |
Hieff® anti-exonuclease of Taq Antibody Taq酶5'→3'外切酶單克隆抗體 | 31302ES60/80/90/92/93/94 | 100 µg/1/5/10/100/1000 mg | 1153/3653/14653/26353/231753/1969552 | / | |
參考文獻(xiàn)
【1】Michael R. Green, Joseph Sambrook. Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)[J]. 2018, 2018(5):pdb.prot095125.
【2】Kermekchiev, M. B . Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2003, 31(21):6139-6147.
【3】Chou Q , Russell M , Birch D E , et al. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications[J]. Nucleic Acids Research, 1992, 20(7):1717-1723.
【4】劉峰濤,柴立輝,馬遠(yuǎn)方.DNA聚合酶適配子6-10提高定量PCR的特異性[J].臨床檢驗雜志,2009,27(03):164-166.
