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磁珠是高通量測序過程*產(chǎn)品,，通過磁顆?；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理,，將樣本中目的片段分離?？蓪?shí)現(xiàn)對核酸樣本的高通量自動(dòng)化操作,，廣泛應(yīng)用于基因測序以及分子診斷領(lǐng)域。

背景篇

磁珠的發(fā)明構(gòu)想初來自于挪威科技大學(xué)的化學(xué)家John Ugelstad,，他在1976年以聚苯乙烯為主要材料,，制作出均勻磁化的球體粒子。1979年Vogelstein等報(bào)道在高濃度典化鈉存在的條件下,，玻璃粉末作為吸附劑用于從瓊脂糖凝膠中提取DNA片段,，而后基于硅膠和其他具有親水性表面載體的固相核酸純化技術(shù)廣泛發(fā)展起來。而基于磁性微粒的核酸純化方法就是其中的一種,。

結(jié)構(gòu)篇

雖然到目前為止納米級別的磁珠各式各樣,，表面性質(zhì)不同，分離的原理也不盡相同,，但其材料組成和基本的結(jié)構(gòu)并無太大的差異,。基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)分為三層,，內(nèi)層的是聚苯乙烯,，第二層包裹磁性物質(zhì)（通常是Fe₃O₄），外層是修飾的官能團(tuán)（如羧基）,。其中官能團(tuán)能與核酸結(jié)合,，表面基團(tuán)不同，下游的應(yīng)用也不盡相同,，如核酸提取，純化,，生物素捕獲等,。

圖 磁珠結(jié)構(gòu)示意圖

原理篇

商業(yè)化磁珠產(chǎn)品體系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）,、鹽離子等,。基于SPRI(Solid Phase Reversible Immobilization )技術(shù),， DNA在一定濃度的PEG存在條件下,，NaCl或MgCl₂促進(jìn)條件下,，DNA分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生急劇變化，會(huì)暴露出磷酸骨架上大量的帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán),，與表面帶負(fù)電荷的羧基磁珠結(jié)合,。目前認(rèn)為這種負(fù)負(fù)電荷間的作用是由于帶正電荷的鹽離子的作用（如Na⁺）。帶負(fù)電磷酸基團(tuán)借由解離的鹽離子（如Na⁺）與羧基形成離子橋,，使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面,。利用磁珠的磁性，可通過外加磁場進(jìn)行收集洗脫,。

圖 磁珠吸附DNA原理示意圖

操作篇

受益于高通量測序技術(shù)的發(fā)展,，磁珠也憑借其高通量，適用于自動(dòng)化的特點(diǎn)備受推崇,，廣泛用于NGS文庫構(gòu)建中DNA純化/雙輪分選（片篩）,。

DNA純化的目的在于去除不想要的片段，由于磁珠優(yōu)先吸附大片段,，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段,，丟棄上清（去除非目標(biāo)片段）后將磁珠吸附的DNA洗脫回收。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除,。

圖 DNA純化操作示意圖

DNA雙輪分選（片篩）目的在于從片段化DNA中選擇特定區(qū)域的DNA片段大小,。由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而需通過兩輪磁珠操作進(jìn)行分選,。以分選450-550 bp的片段范圍為例：首先輪磁珠吸附550 bp以上片段,，此時(shí)棄磁珠留上清，則上清中片段為550 bp以下的片段,。第二輪取磁珠吸附450 bp以上（550 bp以下）磁珠,，此時(shí)棄上清，再將磁珠上的目的片段洗脫回收,。常用于NGS文庫構(gòu)建片段分選（片篩）,。

圖 DNA雙輪分選操作示意圖

結(jié)果分析篇

1. 磁珠回收效率

   DNA樣本經(jīng)磁珠純化后會(huì)有部分樣本的損失，磁珠回收效率可評估磁珠的回收能力,。具體可通過計(jì)算得出：回收效率=（純化后的DNA質(zhì)量/Input DNA質(zhì)量）×100%,。

   以下表為例，相同的比例條件下：測試人1測試A樣本回收效率=153.25/169.5=90.41%,，同理可計(jì)算其他樣本的回收效率,。

表 磁珠回收效率計(jì)算

【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司, 表格中A為AMPure XP磁珠；B,、C,、D分別是翊圣磁珠三個(gè)不同批次。

2. 磁珠分選精度

   由于二代測序段短讀長的局限性,，因而終的NGS文庫需滿足一定的長度要求,。因而NGS建庫中可能會(huì)分選特定長度區(qū)間的片段,，滿足上機(jī)需求。分選精度則是評估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小,。一般以Agilent 2100儀器檢測,。

   在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）條件下，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置,。較好的分選效果圖應(yīng)該是頂部窄而圓潤的獨(dú)峰,。

【注】：數(shù)據(jù)結(jié)果來源于上海某生物公司。值得注意的是：不同廠家磁珠buffer的不同,，導(dǎo)致相同比例條件下分選得到的片段范圍也不一致,，使用前請按照對應(yīng)的磁珠說明書選擇合適的分選比例進(jìn)行操作。

注意事項(xiàng)篇

1. 磁珠使用前需平衡至室溫,，否則影響實(shí)驗(yàn)效果（PEG分離效果易受pH,、溫度等影響）；

2. 用于磁珠洗脫的80%無水乙醇需現(xiàn)用現(xiàn)配,；

3. 長度分選時(shí)建議初始體積≥100 μL,，不足時(shí)請用超純水補(bǔ)齊（樣品體積太小，將導(dǎo)致移液誤差增大,，進(jìn)而影響分選的準(zhǔn)確性）,；

4. 磁珠分選時(shí)特別注意輪分選后棄含大片段的磁珠，第二輪棄含小片段的上清,；

5. 輪分選轉(zhuǎn)移上清時(shí),，避免吸到磁珠，引起大片段殘留,；

6. 分選/純化產(chǎn)物如需長時(shí)間存放請用TE buffer洗脫保存,。

FAQ篇

看起來很簡單的純化/分選實(shí)驗(yàn)，卻在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中有各種意外的情況,。那關(guān)于產(chǎn)品選擇以及使用方面我們實(shí)際操作中有什么需要注意的事項(xiàng)呢,？

產(chǎn)品應(yīng)用：

1. 磁珠可以吸附ssDNA嗎？

A：可以回收單鏈DNA,，具體性能沒有測試過,。附圖是Beckman磁珠回收單鏈DNA的數(shù)據(jù)，可以作為參考,。

2. 分選磁珠可以純化gDNA嗎,？

A:翊圣分選磁珠測試過大20kb的片段，回收率>90%,。基因組 DNA 未測試過,，測試時(shí),，由于大DNA與磁珠結(jié)合的非常緊,，建議盡量增加洗脫液體積，避免干燥時(shí)間過久,。

3. 磁珠的DNA結(jié)合能力怎么樣,？

A：在目前的磁珠體系中，磁珠的吸附能力均為過飽和,，客戶不必?fù)?dān)心磁珠結(jié)合能力不足的情況,。根據(jù)已知的報(bào)道，每1 μL磁珠可以結(jié)合7 μg DNA,。

4. 使用磁珠吸附小片段的時(shí)候,，大片段也會(huì)吸附上來嗎？

A: 磁珠優(yōu)先吸附大片段,，增大磁珠投入量時(shí),，磁珠會(huì)在吸附大片段的基礎(chǔ)上增強(qiáng)吸附小片段的能力。舉例說明：

參考磁珠純化分選表,，100 μL樣本,，加入80 μL磁珠Cat#12601,此時(shí)磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是,，當(dāng)磁珠投入量至100 μL時(shí),，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

產(chǎn)品使用效果：

1. 使用磁珠分選/純化之后,，還有小片段殘留是怎么回事,？

A: 小片段殘留大部分是接頭二聚體/引物二聚體。若純化,，降低磁珠比例,；若分選：可適當(dāng)降低二輪磁珠比例可有效改善此類情況。

2. 磁珠回收率低可能的原因是什么,？

A：1）磁珠與DNA混勻不充分,，未能充分吸附。建議反應(yīng)體系充分混勻,；

2）磁珠比例不對,，建議按照說明書進(jìn)行選擇合適的比例；

3）孵育時(shí)間不足,，保證孵育時(shí)間至少5 min,；

4）磁珠分選時(shí)，二輪磁珠吸附的時(shí)候吸到磁珠,?？稍?/span>200 μL 槍頭前串聯(lián) 10μL槍頭用于移液，可防止吸到磁珠；

5）磁珠洗滌時(shí)的乙醇非現(xiàn)配,，導(dǎo)致乙醇濃度過低,，建議乙醇濃度不低于70%；

6）干燥過度：磁珠長時(shí)間干燥導(dǎo)致表面龜裂,，DNA難以洗脫,，得率降低；建議干燥時(shí)間不宜過長,，表面剛出現(xiàn)龜裂即可,；

7）洗脫液體積不足：終洗脫液應(yīng)*覆蓋管內(nèi)磁珠。

產(chǎn)品儲(chǔ)存：

1. 磁珠不小心放在低溫（-20℃）凍了一段時(shí)間,，還能用嗎,？

A：不能使用，低溫會(huì)破壞磁珠表面集團(tuán)的修飾,，影響磁珠回收性能,。

關(guān)于我們

翊圣生物是專注于分子酶原料創(chuàng)新研發(fā)的gao新技術(shù)企業(yè)。而磁珠是NGS文庫構(gòu)建*產(chǎn)品,。根據(jù)市場磁珠需求,，YEASEN集中專業(yè)人員，致力于磁珠系列產(chǎn)品的創(chuàng)新開發(fā),，目前已經(jīng)擁有多款核酸純化類磁珠產(chǎn)品,，可應(yīng)用于高通量測序與核酸純化。

圖 翊圣磁珠系列產(chǎn)品

磁珠產(chǎn)品選擇指南

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