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得不到陽性克??？可能是忽視了這些細節(jié)……
過去，提起“分子克隆"或“載體構建"這兩個詞,，大家可能想到的是傳統(tǒng)“酶切酶連法",，即用限制性內切酶產生黏性末端，通過堿基互補配對,，連接兩個片段的克隆方法,。
近年來，“同源重組技術"逐漸受到科研人員的歡迎,，如翊圣Hieff Clone®一步法快速克隆技術,。相比之下，同源重組技術操作更加簡單,，不受到酶切位點的限制,，可一次進行多個片段的拼接，大大的提高了克隆效率,。
雖然同源重組技術操作簡單,，但畢竟實驗過程是環(huán)環(huán)相扣的，一旦某個細節(jié)處理不好,，都可能導致實驗失敗,。為此，小編精心整理了同源重組實驗的常見問題,，并給出了可能的原因和解決方案,。希望新手們在遇到類似問題時可快速判斷可能的原因，節(jié)省時間,，更順利的完成實驗,。
常見問題分類：
無克隆。
假陽性,。
菌落PCR無條帶,。
酶切鑒定多條帶。
無克隆
出現無克隆的現象,，可能的原因主要是連接不成功或連接成功,，但轉化失敗,。具體原因分別如下：
1、 連接不成功,。
可能原因 | 解決方法 |
1）引物設計錯誤,。 | 1）設計原則：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位點(根據實驗需求保留或刪除)+基因特異性引物,。 2）判斷方法：可用翊圣無縫克隆引物設計軟件核對,，鏈接：h、t,、t,、p :122.112.245.84:8080/hieff-clone/ |
2）載體與目的片段使用比例失調。 | 1）載體和目的片段濃度測定方法：常用吸光度法或瓊脂糖電泳法,。 2）載體與目的片段添加比例： ①單片段建議：適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3,，載體使用量為0.03 pmol；目的片段使用量為0.06-0.09 pmol,。 ②多片段建議：適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03 pmol,。 |
3）載體與目的片段不純。 | 1）推薦對線性化載體,、PCR產物進行膠回收純化,。 2）純化產物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存。 3）若為未純化的DNA,，加入總體積不超過反應體系體積1/5,。 |
4）操作問題或試劑盒失效。 | 建議做試劑盒附帶的陽性對照實驗,。判斷方法： 1）若陽性對照有克隆并檢測為陽性,，則排除試劑盒問題。 2）若陽性對照無克隆,，可能是操作問題或試劑盒失效,，建議換其他人或換試劑盒進行陽性對照實驗，進一步確定問題,。 |
2,、 連接成功，但無克隆,。
可能原因 | 解決方法 |
1）感受態(tài)細胞效率低,，＜107 cfu/μg。 | 建議用轉化效率大于107 cfu/μg的感受態(tài)細胞,。 判斷方法：可轉化0.1ng質粒（如PUC19）,，觀察克隆數，若生長大于1000個菌斑，則轉化效率大于107 cfu/μg,。 |
2）抗生素種類錯誤,。 | 建議將未線性化載體轉化涂板。 判斷方法：若未長克隆,，則可能是抗性種類錯誤或濃度過高,。需檢查質粒圖譜確認抗性或確認適濃度。 |
假陽性
出現假陽性的情況,，主要表現有兩種,，克隆不含插入片段或含有錯誤的插入片段。具體原因分別如下：
1,、克隆不含插入片段（空載）,。
可能原因 | 解決方法 |
1）載體線性化不*。 | 建議將已制備的線性化的載體轉化涂板,。 判斷方法：如果長克隆較多，則表示線性化不*,。建議優(yōu)化酶切體系,。 |
2）體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質粒。 | 1）產生原因： ①以反向PCR方式進行載體線性化,，殘留環(huán)狀質粒模板導致,。 ②目的基因PCR模板為與載體相同抗性的環(huán)狀質粒，殘留環(huán)狀 質粒模板導致,。 2）判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉化涂板,，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質?；烊?。建議PCR擴增產物先用DpnI 消化模板后，再進行膠回收純化處理或直接進行膠回收純化處理,，去除殘留的環(huán)狀模板質粒導致的假陽性,。 |
2、克隆含有錯誤的插入片段,。
可能原因 | 解決方法 |
1）PCR產物混有非特異擴增產物,。 | 1）可能情況：PCR擴增目的基因時有非特異條帶出現，未進行膠回收純化,。 2）解決方案： ①優(yōu)化PCR體系,，提高特異性； ②膠回收PCR產物,； ③鑒定更多的克隆,。 |
2）片段缺失。 | 1）可能情況：載體或片段有多個同源重復序列。 2）解決方案：借助網站或軟件進行序列比對（如NCBI,， Vector NTI等）,。 |
菌落PCR無條帶
出現菌落PCR無條帶的現象，可能與PCR擴增或重組連接有關,，具體原因分別如下：
可能原因 | 解決方法 |
1）菌落PCR引物錯誤,。 | 建議用載體的通用引物進行菌檢，或至少使用一條通用引物,。 |
2）PCR體系或程序不合適,。 | 1）可能情況：用目的片段引物和載體通用引物擴增都無產物。 2）解決方案： ①優(yōu)化PCR體系,、程序,； ②提取質粒，以質粒做模板PCR驗證,； ③換酶切法鑒定克隆,。 |
3）連接失敗。 | 1）判斷方法：目的引物或一端載體通用引物,，另一端目的引物擴增無條帶,，但載體通用引物擴增有條帶，且大小符合空載,。 2）可能原因：載體線性化不*,。建議優(yōu)化酶切體系。 |
酶切鑒定多條帶
可能原因 | 解決方法 |
重組載體上有多個相同的酶切位點,。 | 1）換其他酶切位點進行酶切鑒定,； 2）更換克隆鑒定方法，如換成菌落PCR或測序鑒定,。 |
以上同源重組的常見問題您中槍過嗎,？若有，快來“對號入座“吧,。如果還有其它更多關于一步法快速克隆的問題,，歡迎留言或來電。
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