聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
- 網址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
背景介紹
熒光素酶生物檢測技術誕生于1990年，已有供了更可靠的研究30年的發(fā)展史,。單熒光素酶檢測系統(tǒng)到雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展,，為科研人員提供了更為嚴謹的實驗手段。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在原有的基礎上引入了海腎報告基因,，可以排除不同組之間細胞生長狀況,、細胞數目以及轉染效率帶來的干擾,，起到校正的作用，從而使實驗結果更為可靠,。其發(fā)光原理如下圖1,。
圖1 雙熒光素酶發(fā)光原理
實驗方案
將靶基因的轉錄調控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游,，以研究啟動子的強弱和轉錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調控作用,。如圖2.
圖2 報告基因系統(tǒng)用于基因表達調控研究
實驗應用
1）啟動子、增強子,、轉錄因子的研究；
2 ) 信號轉導通路的研究,；
3）蛋白質相互作用,；
4）miRNA、LncRNA,、siRNA等的研究,。
。,。,。
雙報告基因檢測試劑盒多用于動物細胞中，也有相關科研人員以植物為研究對象,。不同的研究對象其操作流程有一定的差異,。這里為大家提供細胞、煙草葉片和原生質體這三種研究對象對應的操作流程：
一,、細胞篇
1,、制備重組質粒
2、共轉染：將Luc/Ren載體和目的基因進行共轉染,，通常24-48h(選擇轉染效率較高的細胞如293T),，載體的轉染比例要進行摸索（如1:10、1:20,、1:50,、1:100），原則上海腎熒光素酶讀值不蓋過主報告基因讀值為好,。具體的轉染流程參照相關說明書,；
3、細胞裂解處理
a: 對于貼壁細胞,，吸盡細胞培養(yǎng)液,，按照下表比例加入細胞裂解液，輕輕旋轉培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂
解液*覆蓋細胞,；
b: 對于懸浮細胞,，離心棄去上清,，按照下表比例加入裂解液；
細胞培養(yǎng)板 | 96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 |
裂解液加入量 | 100μL | 150μL | 200μL | 300μL | 500μL |
冰上孵育5min,，充分裂解細胞,。10000-16000rpm離心1min，取上清,；
4,、熒光檢測（使用含有生物發(fā)光或化學發(fā)光模塊的酶標儀）
取20 μL細胞裂解液，加至黑色酶標板中,。加入100 μL 1×螢火蟲熒光素酶反應液,，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力; 加入100 μL 1×海腎熒光素酶反應液,，檢測海腎熒光素酶的活力,。兩個反應都在30min完成。
5,、數據分析：實驗結果為Luc值與Ren值之比,。
二、煙草葉片篇
1,、制備重組質粒
2,、農桿菌轉化及培養(yǎng)：質粒轉化比例需要摸索。轉化后需過夜培養(yǎng),，OD600達到0.8以上即可,；
3、利用無針頭注射器注射葉片,，（先用針頭在葉片上扎個小孔）（注射煙草頂端以下第3-5片葉片）,；
4、暗培養(yǎng)1d,，光照培養(yǎng)2d;
5,、取葉片進行打孔，8mm-1.5cm即可;
6,、在2mL的EP管中加入預冷的小鋼珠,，放入3-4片煙草葉盤并加入適量的液氮，使用儀器進行研磨破碎（45Hz,，30s）,，加入100μL裂解液，10000-16000rpm離心2min,，取上清20μL進行檢測,。
7、檢測：方法同動物細胞,。
三,、原生質體篇
1,、原生質體的制備：不同植物原生質體的分離略有差異，請參考相關文獻,；
2,、原生質體的計數與活力測定：取少量原生質體稀釋液滴加在0.1mm的血球計數板上，在光學顯微鏡下觀察計數,。用0.01% FDA進行染色,，在顯微鏡下對發(fā)綠色熒光的原生質體進行計數。計算原生質體的活力,。
3,、構建重組載體；
4,、PEG-Ca2+介導原生質體的轉化：用MMG溶液重懸原生質體,。在1.5mL EP管中加入Luc、Ren載體（比例需摸索）,、100μL 原生質體和110μL PEG4000-Ca2+溶液，黑暗處放置20min,，加入W5終止反應,，離心棄上清，用1mL W1溶液重懸原生質體并轉移至細胞培養(yǎng)板中,，25℃靜置培養(yǎng)20h,；
5、原生質體的裂解：將原生質體加入2mL離心管中,，離心收集原生質體,，加入100μL左右的裂解液，冰上孵育10min左右,。10000-16000rpm離心5min,。
6、檢測：取20μL上清至1.5mL EP管中,，檢測方法同動物細胞,。
FAQ
Q1: 如何選擇海腎報告基因質粒,？
A1: 盡量選擇中等強度的啟動子,，如TK啟動子等，不要選擇強啟動子CMV,、SV40等,。海腎基因的表達活性應顯著高于背景組,，同時不干擾螢火蟲熒光素酶報告基因的表達。
Q2: 如何選擇螢火蟲報告基因質粒,？
A2：原則上含有l(wèi)uc基因就可以,，但是不同實驗所需的載體有一定差異,，如研究miRNA、轉錄因子的載體是不同的,。小翊為大家提供了多種研究轉錄因子活性的報告基因載體,，可以直接使用，如果您要自己構建載體,，要注意有些載體沒有啟動子,，需要自行插入啟動子，如pGL3 Basic,。
Q3: psiCHECK-2的主報告基因是海腎報告基因,，而不是螢火蟲報告基因，能用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗嗎,？
A2：該質?？梢杂糜陔p熒光素酶報告基因檢測實驗，本試劑盒的檢測原理是酶和底物的反應,，兩種酶經裂解處理后都會釋放出來,，所以使用該質粒不影響檢測實驗。后的數值為Ren值與Luc值之比,。
Q4: 檢測體系可以自行調整嗎,？
A4: 我們推薦20μL裂解液，100μL螢火蟲熒光素酶底物,，100μL海腎熒光素酶底物,。底物的量可以適當調整，但是要保證底物是足量的,。
Q5: 數值低,，什么原因造成的？
A5: 可能是啟動子活性,、轉染效率低,、裂解不充分、底物失效,、操作不規(guī)范等原因造成的,，具體的原因需要實驗者進行排查。
相關產品
產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（元） | *（元） |
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11402ES60 | 100T | 1265.00 | 752.00 |
11402ES80 | 1000T | 9965.00 | 6852.00 | |
Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11401ES60 | 100T | 349.00 | / |
11401ES76 | 500T | 969.00 | / | |
11401ES80 | 1000T | 1748.00 | / |
相關主題文章
實驗分享▏用數據說話,，教你做雙熒光素酶報告基因實驗
