聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·13年您現(xiàn)在的位置： 首頁> 技術(shù)文章 > 小翊教你做雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/div>
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
背景介紹
熒光素酶生物檢測技術(shù)誕生于1990年，已有供了更可靠的研究30年的發(fā)展史,。單熒光素酶檢測系統(tǒng)到雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴謹?shù)膶嶒炇侄?。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在原有的基礎(chǔ)上引入了海腎報告基因,，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾,，起到校正的作用,，從而使實驗結(jié)果更為可靠。其發(fā)光原理如下圖1,。
圖1 雙熒光素酶發(fā)光原理
實驗方案
將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Firefly luciferase基因的上游,，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游,，以研究啟動子的強弱和轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調(diào)控作用,。如圖2.
圖2 報告基因系統(tǒng)用于基因表達調(diào)控研究
實驗應(yīng)用
1）啟動子、增強子,、轉(zhuǎn)錄因子的研究,；
2 ) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究；
3）蛋白質(zhì)相互作用,；
4）miRNA,、LncRNA、siRNA等的研究,。
,。,。。
雙報告基因檢測試劑盒多用于動物細胞中,，也有相關(guān)科研人員以植物為研究對象,。不同的研究對象其操作流程有一定的差異。這里為大家提供細胞,、煙草葉片和原生質(zhì)體這三種研究對象對應(yīng)的操作流程：
一,、細胞篇
1、制備重組質(zhì)粒
2,、共轉(zhuǎn)染：將Luc/Ren載體和目的基因進行共轉(zhuǎn)染,，通常24-48h(選擇轉(zhuǎn)染效率較高的細胞如293T)，載體的轉(zhuǎn)染比例要進行摸索（如1:10,、1:20,、1:50、1:100）,，原則上海腎熒光素酶讀值不蓋過主報告基因讀值為好,。具體的轉(zhuǎn)染流程參照相關(guān)說明書；
3,、細胞裂解處理
a: 對于貼壁細胞,，吸盡細胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細胞裂解液,，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂
解液*覆蓋細胞,；
b: 對于懸浮細胞，離心棄去上清,，按照下表比例加入裂解液,；
細胞培養(yǎng)板 | 96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 |
裂解液加入量 | 100μL | 150μL | 200μL | 300μL | 500μL |
冰上孵育5min，充分裂解細胞,。10000-16000rpm離心1min,，取上清；
4,、熒光檢測（使用含有生物發(fā)光或化學發(fā)光模塊的酶標儀）
取20 μL細胞裂解液,，加至黑色酶標板中。加入100 μL 1×螢火蟲熒光素酶反應(yīng)液,，震板混勻,，檢測螢火蟲熒光素酶的活力; 加入100 μL 1×海腎熒光素酶反應(yīng)液，檢測海腎熒光素酶的活力,。兩個反應(yīng)都在30min完成,。
5、數(shù)據(jù)分析：實驗結(jié)果為Luc值與Ren值之比,。
二,、煙草葉片篇
1,、制備重組質(zhì)粒
2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化比例需要摸索,。轉(zhuǎn)化后需過夜培養(yǎng),，OD600達到0.8以上即可；
3,、利用無針頭注射器注射葉片,，（先用針頭在葉片上扎個小孔）（注射煙草頂端以下第3-5片葉片）；
4,、暗培養(yǎng)1d,，光照培養(yǎng)2d;
5、取葉片進行打孔,，8mm-1.5cm即可;
6,、在2mL的EP管中加入預(yù)冷的小鋼珠，放入3-4片煙草葉盤并加入適量的液氮,，使用儀器進行研磨破碎（45Hz,，30s），加入100μL裂解液,，10000-16000rpm離心2min,，取上清20μL進行檢測。
7,、檢測：方法同動物細胞,。
三、原生質(zhì)體篇
1,、原生質(zhì)體的制備：不同植物原生質(zhì)體的分離略有差異,，請參考相關(guān)文獻；
2,、原生質(zhì)體的計數(shù)與活力測定：取少量原生質(zhì)體稀釋液滴加在0.1mm的血球計數(shù)板上,，在光學顯微鏡下觀察計數(shù)。用0.01% FDA進行染色,，在顯微鏡下對發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體進行計數(shù),。計算原生質(zhì)體的活力。
3,、構(gòu)建重組載體,；
4、PEG-Ca2+介導(dǎo)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：用MMG溶液重懸原生質(zhì)體,。在1.5mL EP管中加入Luc、Ren載體（比例需摸索）,、100μL 原生質(zhì)體和110μL PEG4000-Ca2+溶液,，黑暗處放置20min,，加入W5終止反應(yīng)，離心棄上清,，用1mL W1溶液重懸原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)板中,，25℃靜置培養(yǎng)20h；
5,、原生質(zhì)體的裂解：將原生質(zhì)體加入2mL離心管中,，離心收集原生質(zhì)體，加入100μL左右的裂解液,，冰上孵育10min左右,。10000-16000rpm離心5min。
6,、檢測：取20μL上清至1.5mL EP管中,，檢測方法同動物細胞。
FAQ
Q1: 如何選擇海腎報告基因質(zhì)粒,？
A1: 盡量選擇中等強度的啟動子,，如TK啟動子等，不要選擇強啟動子CMV,、SV40等,。海腎基因的表達活性應(yīng)顯著高于背景組，同時不干擾螢火蟲熒光素酶報告基因的表達,。
Q2: 如何選擇螢火蟲報告基因質(zhì)粒,？
A2：原則上含有l(wèi)uc基因就可以，但是不同實驗所需的載體有一定差異,，如研究miRNA,、轉(zhuǎn)錄因子的載體是不同的。小翊為大家提供了多種研究轉(zhuǎn)錄因子活性的報告基因載體,，可以直接使用,，如果您要自己構(gòu)建載體，要注意有些載體沒有啟動子,，需要自行插入啟動子,，如pGL3 Basic。
Q3: psiCHECK-2的主報告基因是海腎報告基因,，而不是螢火蟲報告基因,，能用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗嗎？
A2：該質(zhì)?？梢杂糜陔p熒光素酶報告基因檢測實驗,，本試劑盒的檢測原理是酶和底物的反應(yīng)，兩種酶經(jīng)裂解處理后都會釋放出來，所以使用該質(zhì)粒不影響檢測實驗,。后的數(shù)值為Ren值與Luc值之比,。
Q4: 檢測體系可以自行調(diào)整嗎？
A4: 我們推薦20μL裂解液,，100μL螢火蟲熒光素酶底物,，100μL海腎熒光素酶底物。底物的量可以適當調(diào)整,，但是要保證底物是足量的,。
Q5: 數(shù)值低，什么原因造成的,？
A5: 可能是啟動子活性,、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分,、底物失效,、操作不規(guī)范等原因造成的，具體的原因需要實驗者進行排查,。
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（元） | *（元） |
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11402ES60 | 100T | 1265.00 | 752.00 |
11402ES80 | 1000T | 9965.00 | 6852.00 | |
Luciferase Reporter Gene Assay Kit 螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒 | 11401ES60 | 100T | 349.00 | / |
11401ES76 | 500T | 969.00 | / | |
11401ES80 | 1000T | 1748.00 | / |
相關(guān)主題文章
實驗分享▏用數(shù)據(jù)說話,，教你做雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/span>
翌圣生物科技（上海）股份有限公司 - 主營產(chǎn)品： 抗體,小分子抑制劑,熒光染料,干細胞培養(yǎng),血清
化工儀器網(wǎng)設(shè)計制作,，未經(jīng)允許翻錄必究 Copyright(C) http://sorrent.com.cn All rights reserved
以上信息由企業(yè)自行提供，信息內(nèi)容的真實性,、準確性和合法性由相關(guān)企業(yè)負責,，化工儀器網(wǎng)對此不承擔任何保證責任。溫馨提示：為規(guī)避購買風險,，建議您在購買產(chǎn)品前務(wù)必確認供應(yīng)商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量,。
會員登錄
×請輸入賬號
請輸入密碼
請輸驗證碼
提示
X您的留言已提交成功,！我們將在第一時間回復(fù)您~
