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Uracil DNA Glycosylase, Heat-Labile高效預(yù)防PCR氣溶膠污染
——酶活高效,，活性可控
操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結(jié)果假陽性zui常見的因素。美國科學(xué)家Lindahl早在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了UDG酶（Uracil DNA Glycosylase,，尿嘧啶DNA糖基化酶），利用UDG酶選擇性水解含dU的DNA單鏈或DNA雙鏈的機制,，巧妙地引入dUTP取代PCR體系中的dTTP而構(gòu)成了dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng),。穩(wěn)定使用該系統(tǒng)， 可有效消除PCR體系中混入的擴增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在）,，保證擴增結(jié)果的準確性,。
作用原理
dUTP/UDG酶是作為PCR反應(yīng)體系的配制成分發(fā)揮防污染作用的。作用原理是dUTP使得每個擴增反應(yīng)生成的PCR產(chǎn)物成為含有dU的DNA鏈,。為防止此前積累的殘留產(chǎn)物作為模板干擾擴增反應(yīng),，在新擴增反應(yīng)體系進行時，一定溫度下,，UDG酶選擇性的催化水解dU-DNA鏈中的尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架的N-糖苷鍵,，釋放出游離的尿嘧啶，形成有缺失堿基的DNA鏈,。經(jīng)95℃高溫進一步水解斷裂,，從而消除污染。同時高溫使得UDG酶失去活性,，不會水解新的dU-DNA鏈（見圖1）,。
天然的、未經(jīng)修飾的DNA不含dU,，不受UDG酶影響,，繼續(xù)作為PCR/qPCR擴增的模板進行擴增。
圖1. dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)去除殘留擴增污染物示意圖
產(chǎn)品特性
Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile是來源于嗜冷海洋細菌,，經(jīng)大腸桿菌表達純化的重組蛋白,，在25-37℃發(fā)揮活性，熱敏感，50℃ 10 min或95℃ 2 min即發(fā)生不可逆滅活,?？膳c熱啟動Taq酶搭配使用，保證擴增的特異性,。
①10 U本品經(jīng)E.coli 16S rDNA特異性的TaqMan qPCR檢測,，E.coli基因組殘留低于10拷貝。
②無核酸內(nèi)外切酶和RNase殘留,。
③尿嘧啶是此酶識別的唯—堿基,。
dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)使用方法（僅供參考）
1. 根據(jù)實驗需要，dUTP終濃度可在0.2-0.6 mM 之間調(diào)整,，并選擇性摻入0.2 mM dTTP,。
2. 體系中添加UDG酶，添加量1 個單位足矣,。1單位可以30min內(nèi)消化1μg dU-DNA,。
3. PCR反應(yīng)程序前加上25℃-37℃ 2-10min的保溫步驟活化UDG酶活性。
4. 正常進行后續(xù)PCR程序,。
效果展示
圖2. 0.05U,、0.025U、0.0125U,、0.00625U,、0.003125U 熱敏UDG酶與360ng 200bp dU-DNA在25℃孵育30min（95℃ 2min滅活）,。電泳檢測熱敏UDG酶的降解效果,，可以看出0.025U的熱敏UDG就可*消化dU-DNA。
應(yīng)用場景
氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系,，在氣體與液體面摩擦?xí)r（如在渦旋振蕩后未離心直接開蓋,，移液槍反復(fù)吹吸樣品、PCR結(jié)束后開蓋等）易形成,。在分子實驗室中,，因頻繁進行上述操作，并長期進行某些特定基因的擴增易出現(xiàn)氣溶膠污染,。
PCR是一種指數(shù)擴增微量基因片段的核酸檢測技術(shù),，靈敏度*。PCR反應(yīng)體系中極微量的污染物即可引起假陽性結(jié)果,。因反應(yīng)成分多樣,，若體系中存在氣溶膠污染物，假陽性的原因不易排查,，也很難解決,。
dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)可zui大程度的保證PCR、qPCR,、RT-qPCR,、RPA等核酸檢測結(jié)果的準確性,。
除此之外，該系統(tǒng)還可用于定點突變克隆,、二代測序文庫構(gòu)建等實驗,。
FAQ
Q1: UDG酶可以用于已存在的擴增產(chǎn)物氣溶膠污染嗎？
A: 已存在的擴增產(chǎn)物氣溶膠污染不含dU,，此時UDG酶不能發(fā)揮作用,。建議選取其他擴增區(qū)域，重新設(shè)計引物,，并建立dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng),，即可避免“未來”的氣溶膠污染。
Q2: dUTP會影響擴增產(chǎn)物的dU-DNA在雜交,、測序,、克隆和酶切等方面的下游應(yīng)用嗎？
A：含dU的PCR產(chǎn)物可正常進行核酸雜交和測序,，效果與常規(guī)PCR產(chǎn)物無差別,。在分子克隆實驗中，連接產(chǎn)物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒擴增,。酶切實驗中,，已證實EcoRI和BamHI不受dU影響，但HindIII酶切效率有所降低,，更多內(nèi)切酶效果還需自行嘗試,。
Q3: 含dU的PCR產(chǎn)物后續(xù)做了連接和轉(zhuǎn)化，無克隆,，這是什么原因,？
A: 需要特別注意在分子克隆實驗中，連接產(chǎn)物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化和后續(xù)的質(zhì)粒擴增,。
Q4: UDG酶用于RT-qPCR或RT-PCR體系時,，會干擾逆轉(zhuǎn)錄實驗嗎？
A: 可選用耐受性能良好的逆轉(zhuǎn)錄酶,，如Hifair III Reverse Transcriptase *作用溫度50-55℃,，此時熱敏UDG酶活性極低。
Q5: UDG酶會切割RNA嗎,？
A: 不會,。在生物體內(nèi)，UDG酶在DNA修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用,。它可以修復(fù)dC脫氨基形成dU的突變,，進而避免GC堿基對突變?yōu)锳T堿基對的可能。
Q6: UDG酶反應(yīng)Buffer是什么？
A:UDG酶可以在各類緩沖液中發(fā)揮作用,，如常規(guī)的Taq酶Buffer,、連接酶Buffer、酶切Buffer等,。
Q7: UDG酶對DNA鏈的堿基個數(shù)有要求嗎,？
A: 不能從6堿基或更少的寡核苷酸上水解尿嘧啶。
產(chǎn)品訂購
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), heat-labile 熱敏UDG | 10303ES60 | 100 U | 683.00 |
Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), heat-labile 熱敏UDG | 10303ES76 | 500 U | 3083.00 |
Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), heat-labile 熱敏UDG | 10303ES92 | 10000 U | 面議 |
Uracil DNA Glycosylase (UDG) | 10304ES60 | 100U | 582.00 |
Uracil DNA Glycosylase (UDG) | 10304ES76 | 500U | 2782.00 |
dUTP, 100mM Solution 脫氧尿苷三磷酸溶液（100 mM） | 10128ES72 | 250μl | 253.00 |
dUTP, 100mM Solution 脫氧尿苷三磷酸溶液（100 mM） | 10128ES80 | 1ml | 853.00 |
dUTP, 100mM Solution 脫氧尿苷三磷酸溶液（100 mM） | 10128ES96 | 25ml | 面議 |
注：上述產(chǎn)品庫存長期均保留有多個批次以備測試,。
注：上述產(chǎn)品庫存充足,，該類產(chǎn)品已有多家IVD企業(yè)購買用于生產(chǎn)用途。
HB200331
