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RT-qPCR需要注意的那些事,，你都了解嗎？
在RT-qPCR實驗中不論是實驗小白還是老司機,，都會遇到各種不同的實驗問題,。解決問題不僅要浪費額外的樣品和試劑，還要占用大量的時間一遍遍的重復(fù)和分析,，真是被實驗折磨得焦頭爛額,。那實驗過程中應(yīng)該注意哪些細(xì)節(jié)呢？小翊精心為大家總結(jié)了RT-qPCR實驗的注意事項，希望助小伙伴們一臂之力,。
RT-qPCR實驗包括RNA提取與質(zhì)量評估,，逆轉(zhuǎn)錄和qPCR三大步驟，每個步驟都有很多注意事項,，才能做出可靠的數(shù)據(jù),。下面由小翊給您詳細(xì)介紹。
RNA質(zhì)量評估
在RT-qPCR實驗中,，RNA提取完成后,，需要對RNA的質(zhì)量進(jìn)行評估，合格后才可進(jìn)行后續(xù)實驗,。評估方法有分光光度計,，瓊脂糖凝膠電泳，Agilent 2100分析等,，其中常用的有分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測,。我們需要注意的是這兩種方法需要搭配使用，才能完成對RNA濃度,、純度和完整度的檢測分析,，以保證RNA的質(zhì)量。
分光光度計檢測法
分光光度計主要用于測定RNA的濃度和純度,，但不能對RNA的完整度和基因組殘留進(jìn)行檢測。其中,，A260/280和A260/230是RNA純度檢測的重要參數(shù),，可根據(jù)其數(shù)值的波動，檢測RNA的純度：
² 1.9< A260/280< 2.1,，說明RNA純度較好,；A260/280<1.9，表示RNA中可能有蛋白殘留,；A260/280>2.1,，表示RNA可能有部分降解，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn),。
² 2.0< A260/230< 2.2,，說明RNA純度較好；A260/230< 2.0,，則說明RNA中可能有機試劑殘留,，如酚、乙醇或糖類等,。
瓊脂糖凝膠電泳檢測
瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分析RNA的完整度,，基因組和蛋白殘留，但不能對RNA的濃度準(zhǔn)確定量，也不能檢測有機試劑的殘留,。以真核生物RNA模板為例：
² 將RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，若膠圖上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶,，說明提取的RNA完整度良好,。如果出現(xiàn)拖帶的現(xiàn)象，表示RNA部分降解,。
² 若膠孔和28sRNA條帶之間出現(xiàn)單一明亮的條帶,，表示可能有基因組DNA殘留。
² 若膠孔內(nèi)出現(xiàn)條帶,，說明可能有蛋白等大分子物質(zhì)殘留,。
逆轉(zhuǎn)錄
RNA提取完成后，需要反轉(zhuǎn)成cDNA才能進(jìn)行后續(xù)實驗,，所以反轉(zhuǎn)步驟是*的,。逆轉(zhuǎn)錄將從逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇和引物的選擇進(jìn)行介紹：
逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇
常見代表性反轉(zhuǎn)錄酶有AMV RTase和MMLV RTase兩大類：AMV RTase的RNase H活性強，合成長度短,，合成量低,，熱穩(wěn)定性好（42～55℃）；MMLV RTase的RNase H活性弱,，合成長度長,，合成量高，熱穩(wěn)定性差（37～42℃）,。
由于RNase H酶具有降解RNA模板的功能,，所以在逆轉(zhuǎn)錄時應(yīng)該優(yōu)先選擇RNase H活性弱的MMLV ，而且后期經(jīng)過基因工程改造,，MMLV熱穩(wěn)定性已達(dá)到質(zhì)的飛躍,。以Yeasen的Hifair® Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶（11141）為例，該酶經(jīng)基因工程改造,，刪除了RNase H活性,，同時反應(yīng)溫度可達(dá)60℃，針對高GC及富含復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板具有更高的反轉(zhuǎn)錄效率,。
引物的選擇
通常RT primer可分為三類：oligo dT,，隨機引物和基因特異性引物。根據(jù)不同的實驗需求選擇適合的引物進(jìn)行使用,。
² 如果模板為真核生物來源,，且后期cDNA用于常規(guī)PCR擴增，建議選擇Oligo（dT）,；若后續(xù)實驗僅用于qPCR,，建議將Oligo（dT）與隨機引物混合后使用,，可提高反轉(zhuǎn)錄效率。
² 如果模板為原核生物來源,，反轉(zhuǎn)錄請選用Random Primers 或者基因特異性引物,。
熒光定量
熒光定量主要從定量方法的選擇、引物設(shè)計原則,、ROX的選擇,、反應(yīng)體系的配置和反應(yīng)條件的設(shè)置等分別進(jìn)行闡述：
定量方法的選擇
定量方法分為相對定量和定量。相對定量可用于檢測某種處理方法對基因表達(dá)的影響,，檢測基因在不同時間的表達(dá)差異和比較基因在不同組織中的表達(dá)差異,；定量可對病毒中核酸的量進(jìn)行檢測等。大家在做實驗時,，一定要根據(jù)自己的實驗選擇合適的定量方法,。
引物設(shè)計原則
qPCR引物設(shè)計的好壞，直接關(guān)乎著擴增效率高低,，產(chǎn)物特異性與否,。所以正確設(shè)計出好的引物是qPCR成功的第—步。引物設(shè)計在滿足常規(guī)引物設(shè)計的原則上還要注意以下原則：
² 目的片段長度控制在100 ~ 300 bp,；
² 跨外顯子設(shè)計,，避免基因組DNA的影響；
² 設(shè)計的引物需要進(jìn)行擴增效率的檢測,，擴增效率達(dá)標(biāo)（90-110%）才可用于定量實驗,；
² 引物濃度通常在0.1uM-1.0uM之間優(yōu)化選擇。
ROX的選擇
在定量反應(yīng)過程中,，ROX能夠均一化校正儀器的光程差,，移液誤差或蒸發(fā)冷凝導(dǎo)致的體積差等，提高結(jié)果的重復(fù)性,。但需要注意的是ROX的選擇與儀器相關(guān)，如果qPCR儀有自動校正孔間差的功能,，就不需要添加ROX,，反之則需要添加ROX校正。小伙伴們在買試劑時一定要根據(jù)所用的儀器型號選擇正確ROX,，避免后期出錯,。
反應(yīng)體系的配制
反應(yīng)體積優(yōu)先推薦20ul和50ul。體系配制時要注意以下事項：
² 反應(yīng)體系需要在超凈工作臺中通風(fēng)配制,；每次實驗都要用新的ddH2O,；
² 每次實驗都需要配制NTC來驗證體系中是否存在污染，配制體系時每一對引物都需要做NTC,；
² 如果想檢測RNA模板是否有g(shù)DNA殘留,，可將每個樣本都配制NRT進(jìn)行檢測,；
² 配制體系時，一個樣本建議至少做3個技術(shù)型重復(fù),；
² 模板為cDNA時,，建議稀釋5-10倍，減少反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR實驗的抑制作用,，模板量進(jìn)行梯度摸索,，使CT值落在20-30之間*；
² 確定所需的反應(yīng)數(shù)量,，在反應(yīng)數(shù)量的基礎(chǔ)上增加5-10%,，計算體積配置數(shù)量；
² 體系配制采用能預(yù)混則預(yù)混原則,，混勻后離心并保證無氣泡,；
² 盡量選擇進(jìn)口且配套的耗材，如ABI儀器使用ABI封板膜,，伯樂儀器使用配套的白色陶瓷板子,。
反應(yīng)條件的設(shè)定
不同的熒光定量酶可能反應(yīng)條件不一樣。比如Yeasen的熒光定量酶就分為配體法熱啟動酶和抗體法熱啟動酶,，關(guān)于這兩種酶反應(yīng)條件的設(shè)定需要注意以下幾點：
² 設(shè)置程序時要注意配體法的預(yù)變性為95℃,，5min；抗體法的預(yù)變性為95℃,，30s,。；
² 選擇兩步法,，可保證產(chǎn)物高特異,，選擇三步法可保證率擴增，小伙伴可根據(jù)自己的實驗選擇合適的程序,。
² 上機時盡量避免使用外面一圈的孔,。
以上就是小翊對RT-qPCR注意事項的詳細(xì)總結(jié)，希望能夠?qū)Υ蠹业膶嶒炗兴鶐椭?。小翊在這里提前祝大家中秋快樂,，實驗順利。
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