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熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)是分子實(shí)驗(yàn)室常用的一項(xiàng)技術(shù),。持續(xù)關(guān)注小翊的應(yīng)該都掌握了高質(zhì)量cDNA的獲取方法,，引物設(shè)計(jì)指南以及反應(yīng)體系的配制技巧（還未get的小伙伴戳文末鏈接）,，然而上機(jī)時(shí),，發(fā)現(xiàn)和別人的反應(yīng)條件不一致卻又不敢動(dòng)儀器,？本期小翊將帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器的設(shè)置！
目前市面上的qPCR儀器種類五花八門,，但基本上儀器的設(shè)置都相對(duì)一致,。我們以ABI 7500為例進(jìn)行介紹。
- 反應(yīng)板設(shè)置
- 實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：我們將實(shí)驗(yàn)命名為“Yeasen”,，進(jìn)行“Quantitation： Δ Δ Ct”
實(shí)驗(yàn),。
- 實(shí)驗(yàn)方法選擇：如選用SYBR Green標(biāo)記方法， 標(biāo)準(zhǔn)程序,。
- 目的基因和模板的設(shè)置：每個(gè)Target和Sample命名,，Target包括目的基因、內(nèi)參基因,，Sample包括實(shí)驗(yàn)組,、對(duì)照組、負(fù)對(duì)照組,。
- 反應(yīng)孔的設(shè)置：根據(jù)樣品的排布選中面板上的加樣孔,，勾選左邊對(duì)應(yīng)的目的基因及模板。
注意：不應(yīng)為了方便將所有孔選成同一個(gè)Target同一個(gè)Sample,，這樣排布會(huì)造成比較大的風(fēng)險(xiǎn),。我們通過(guò)下面的例子進(jìn)行說(shuō)明：
（圖源自網(wǎng)絡(luò)）
我們同一塊板上同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)基因,，而布孔時(shí)選成同一個(gè)Target，那么儀器默認(rèn)的都是同一個(gè)閾值,，假如布孔時(shí)都選成Target1,，紅色這條閾值線對(duì)于Target1是合理的，但對(duì)于Target2則不合理,，因?yàn)檫@時(shí)已經(jīng)不在指數(shù)擴(kuò)增期,，得到的Ct值并不可信。
- 反應(yīng)程序設(shè)置
- 擴(kuò)增程序
- 預(yù)變性
qPCR的模板可以是cDNA或gDNA,，預(yù)變性這一步可以使雙鏈DNA或cDNA-RNA結(jié)合物解鏈,，以利于引物更好的和模板結(jié)合。另外在使用熱啟動(dòng)Taq酶的反應(yīng)中,，還可激活Taq酶,，從而使反應(yīng)得以順利進(jìn)行。如Yeasen Hieff系列定量產(chǎn)品的預(yù)變性設(shè)置為95℃ 5min,。
- 變性
qPCR反應(yīng)的產(chǎn)物比較短,，一般10-30s的變性時(shí)間就已足夠。
- 退火/延伸
qPCR反應(yīng)可以將退火與延伸兩步進(jìn)行合并,。條件需要根據(jù)引物和目的基因的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整，根據(jù)qPCR引物設(shè)計(jì)原則,，引物的Tm值在60℃左右,，因此這一步的溫度一般可設(shè)為60℃。時(shí)間還需根據(jù)儀器使用要求進(jìn)行設(shè)置,，如ABI StepOne,、Bio-Rad CFX96、Roche LightCycler 480至少需要設(shè)置30s,，而ABI 7500則至少需要設(shè)置34s,。
- 循環(huán)數(shù)
循環(huán)階段從變性到退火、延伸,，循環(huán)數(shù)一般設(shè)為40,。
- 熒光信號(hào)采集
對(duì)于染料法而言，兩步法檢測(cè)的熒光信號(hào)采集應(yīng)該在退火延伸的整合步驟,；三步法應(yīng)當(dāng)在72℃延伸時(shí)采集,，此時(shí)絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài)；Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào),。以ABI 7500為例,，選擇在哪一步采集熒光信號(hào)點(diǎn)亮其下面的小方塊即可。
注：市面上不同公司生產(chǎn)的熒光定量產(chǎn)品的反應(yīng)程序有所不同,，建議根據(jù)說(shuō)明書推薦的程序進(jìn)行設(shè)置,，以得到蕞優(yōu)的擴(kuò)增效率,。
- 熔解程序
使用染料法進(jìn)行熒光定量PCR時(shí)，我們通常會(huì)在擴(kuò)增階段完成后進(jìn)行熔解曲線分析,，幫助確定產(chǎn)物類型,，判斷是否有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。以SYBR Green法為例,，SYBR Green染料只有結(jié)合到雙鏈DNA的小溝中才能發(fā)出熒光,，擴(kuò)增反應(yīng)完成后，對(duì)產(chǎn)物逐漸升溫同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào),，隨著溫度升高,，DNA雙鏈解開，產(chǎn)物熒光信號(hào)下降,。溫度一般設(shè)置在60℃-95℃區(qū)間,，能包含產(chǎn)物Tm值和非特異產(chǎn)物Tm值即可。在某個(gè)溫度下,，雙鏈DNA會(huì)解鏈一半,，此后剩下的一半會(huì)迅速解鏈，熒光驟降并形成變化的拐點(diǎn),，這個(gè)溫度稱為退火溫度（Tm值）,。將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT)，從而生成熔解曲線,。
Tm值受產(chǎn)物長(zhǎng)度,，GC含量和離子環(huán)境等影響。因?yàn)槟康漠a(chǎn)物長(zhǎng)度在80-300bp,，Tm值一般高于80℃,，而引物二聚體比較小，大多Tm值低于75℃,。而同一產(chǎn)物Tm值用不同品牌的試劑擴(kuò)增時(shí),，Tm值會(huì)有所區(qū)別也是因?yàn)?span style="font-family:times new roman,serif">buffer成分的不同，如含有促解鏈的DMSO成分多,，Tm值則相對(duì)低一點(diǎn),。
熔解曲線通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序或者是儀器說(shuō)明書上建議的程序，無(wú)需變動(dòng),。
這幾個(gè)步驟設(shè)置好,，可以保存、修改或者直接點(diǎn)擊“START RUN”進(jìn)行反應(yīng),。
- 結(jié)果分析
- 閾值設(shè)置（可選）
Ct值是擴(kuò)增曲線和閾值線的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù),，閾值改變Ct值也會(huì)隨之變動(dòng)。但實(shí)際上，只要將閾值線設(shè)定在合適的范圍內(nèi),，任何兩個(gè)樣品間的△Ct值都會(huì)保持不變,，依然可以依據(jù)△Ct值來(lái)計(jì)算不同樣本間基因表達(dá)量的倍數(shù)變化。
閾值線不能太低,，否則會(huì)受到噪音信號(hào)的干擾,。反之，如果設(shè)置的太高,，到達(dá)擴(kuò)增線性期或平臺(tái)期,，數(shù)據(jù)則不準(zhǔn)確，設(shè)置方法有兩種：
- 設(shè)為儀器默認(rèn)值,。點(diǎn)擊Analyze（分析）按鈕時(shí),，軟件會(huì)自動(dòng)為我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)置好每一個(gè)Assay的蕞佳閾值線。
- 手動(dòng)設(shè)置,?？砂醋￠撝稻€上下拖動(dòng)，需要設(shè)置在擴(kuò)增曲線接近線性和線與線之間相互平行的位置,，即樣本重復(fù)性*的區(qū)域,，通常是在指數(shù)擴(kuò)增期的中期或后期。
- 參比染料
ROX是qPCR實(shí)驗(yàn)中使用的一種參比染料,，用于均一化校正儀器的光程差,、移液誤差或蒸發(fā)冷凝導(dǎo)致的體積差等，提高結(jié)果的重復(fù)性,。ABI的儀器一般都需要在反應(yīng)體系中添加ROX,，結(jié)果分析時(shí)默認(rèn)的是ROX，如果使用的Master mix里沒(méi)有添加ROX,，也可以勾選NO ROX分析。但考慮到移液誤差,、人為差異在qPCR實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)性,，建議根據(jù)儀器型號(hào)添加相應(yīng)濃度的ROX。并且,，ROX還可以作為故障分析的依據(jù),，無(wú)ROX信號(hào)，可以很明確地說(shuō)明沒(méi)有放置Master Mix試劑,；ROX信號(hào)不規(guī)則變化,，說(shuō)明儀器可能存在故障。
Yeasen生物提供ROX混在Maste mix里面或不同濃度ROX單獨(dú)成管的Master mix,，兼容各種類型的定量?jī)x器,。
讀到這里，你的qPCR儀器使用技能是否已解鎖,？想要獲取更多干貨戳下文,，下一個(gè)熒光定量高手就是你,！
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