聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機(jī)：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
NGS測序技術(shù)近年來得到了巨大發(fā)展,，2017年摩根大會上,，Illumina重磅推出NovaSeq測序儀,，NovaSeq可以2天產(chǎn)生2Tb數(shù)據(jù)，通量是10年前Genome Analyzer的2000倍,。測序通量的大幅增加,，意味著更多的樣本混合上機(jī)，這樣的話我們?nèi)绾卧诿Ｃ?shù)據(jù)中找到對應(yīng)樣本匹配的數(shù)據(jù)呢？人們想到了一種在文庫構(gòu)建時在接頭上添加“接頭暗號"的方法,，在測序完成之后根據(jù)“接頭暗號"對樣本進(jìn)行分離,。這里的接頭暗號就是樣本標(biāo)簽“Index/Barcode"。本文將以建庫過程中要添加的接頭為核心,，對其進(jìn)行全面介紹,。
1.接頭是什么？
接頭的本質(zhì)是一段短的堿基序列,，基本包括三個部分：與flow-cell上面寡核苷酸相同或互補(bǔ)的片段P5/P7,；測序時測序引物結(jié)合部分R1/R2；用于區(qū)分不同樣本的Index,。接頭是待測DNA片段與Flow-cell連接的橋梁,，目的片段連接接頭后可以在flow cell上擴(kuò)增再測序。
圖1.兩端添加接頭的DNA片段
2.接頭如何分類,？
接頭的分類方法主要有兩種,，一是按照Index的位置，二是按照是否匹配PCR free建庫,。
（1）根據(jù)Index位置可以將接頭分為單端Index接頭和雙端Index接頭,。單端Index接頭指的是僅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端），雙端Index接頭指的在P5和P7端均存在Index,。（如圖2所示）,。Index的數(shù)目直接影響最終上機(jī)能混合的樣本數(shù)目，雙端Index具有比單端Index能容納更多數(shù)目的樣本,，近年來為了滿足一次能測量更多的樣本的需求,，雙端帶Index的接頭被廣泛使用。
圖2：接頭按照Index位置分為單端Index接頭和雙端Index接頭,，兩種接頭連接后示意圖
（2）根據(jù)接頭是否匹配PCR free建庫可以將接頭分為長接頭和短接頭（見圖3）,。長接頭又稱為完整接頭，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2,，完整接頭通過TA克隆的方式連接到DNA片段之后,，可不進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)直接上機(jī)測序（DNA量足夠上機(jī)測序時可直接上機(jī)，當(dāng)DNA量不夠時還需進(jìn)行PCR擴(kuò)增使得產(chǎn)物達(dá)到一定的量方可上機(jī)測序）,。短接頭通過TA克隆方式連接到DNA片段上后,，必須與短接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物就是包含完整接頭的DNA片段（見圖4）,。也就是說短接頭最終一定要通過PCR擴(kuò)增成為完整接頭才能上機(jī)測序,。
圖3：左邊為Illumina早期推出的短接頭，不包含Index,；右邊為長接頭,，是Illumina目前標(biāo)準(zhǔn)通用接頭樣式
圖4：短接頭建庫流程圖
3.Index有何奧秘,？
Index作為接頭中的重要組成部分到底有著怎樣的奧秘呢？簡單來說Index就是混合樣本中不同樣本的“身份",，其本身就是一段堿基序列,，一般長6nt或8nt。通過對這種“身份"的識別,，就可以在混合樣本中對單個樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行識別,。那么問題來了，四種堿基隨機(jī)構(gòu)成的排列組合序列那么多,，這些都可以用作Index嗎,？選擇Index序列的依據(jù)又是什么呢？
Index的選擇需滿足兩個原則：堿基平衡和激光平衡
a）堿基平衡：是指Index序列的復(fù)雜度和平衡度：復(fù)雜度指的是堿基的種類的多樣,；平衡度指的是堿基之間分布比例的均衡,。需要注意的是堿基的平衡是指多個Index之間的平衡，而不是單個index內(nèi)部的堿基平衡,。好的Index序列應(yīng)該是均含有A,、T、C,、G四種堿基，且各堿基之間的比例接近25%,，如圖5所示,。
圖5：符合堿基平衡的Index號（ATGC,TACG,GCTA,CGAT）舉例，分別符合單個Index內(nèi)部平衡和多個Index相應(yīng)堿基位的堿基平衡
b）激光平衡：是指在一組Index序列中需滿足每個堿基位A + C =G + T,，在Illumina測序儀中,，A和C兩種堿基共用一種激光，由波長660nm的紅激光激發(fā),；G和T共用一種激光,，由波長532 nm的綠激光激發(fā)。需要說明的是激光平衡是在堿基不平衡的情況下的無奈之舉,，在一定程度上可以提高index測序時的堿基識別質(zhì)量,，減少數(shù)據(jù)分離時出問題的可能性，見圖6,。
圖6：不符合堿基平衡但符合激光平衡的Index號（ATGC,TACG,AGAG,TCTC）舉例
如樣本數(shù)為單數(shù),，則必然無法滿足堿基平衡和激光平衡，此時可以選擇幾個縱列是互補(bǔ)的兩個Index,，再加上一個其他的Index,，可保證測序質(zhì)量。
結(jié)語
高通量測序技術(shù)的發(fā)展,，使得測序的通量不斷增加,，通量的增加就意味著多樣本混合上機(jī)測序,。由此而來的問題是在NGS的過程中如何做到對每個樣本數(shù)據(jù)的對號入座?？茖W(xué)家想到給樣本一個“身份",，這樣就可以憑證識別。因此對于NGS從業(yè)者來說,，在享受高通量測序帶來的方便快捷的同時,，還要記得給自己的樣本戴好‘證件’哦。
