近年來，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用得到了進(jìn)一步的發(fā)展,，在診斷動(dòng)物的病毒性,、細(xì)菌性和寄生蟲性疫病中得到了廣泛的應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光PCR不僅實(shí)現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的飛躍,，而且與常規(guī)PCR相比,，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，提高了特異性,，并且由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性,，又可進(jìn)一步提高靈敏度,；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理,，避免污染,，了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。隨著實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的進(jìn)一步開發(fā),，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)將會(huì)在動(dòng)物疫病診斷中得到更加廣泛的應(yīng)用,。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出,，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。目前報(bào)道的熒光探針主要有Taqman,，Amplisensor，分子標(biāo)信,，Lightcyclor以及在這4種探針基礎(chǔ)上發(fā)展起來的熒光探針,。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量，而且與常規(guī)的PCR相比,，具有靈敏性和特異性高,，能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高,、無污染,、實(shí)時(shí)和等特點(diǎn),。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域,，特別是近幾年來在動(dòng)物疫病的診斷中得到了廣泛的應(yīng)用,。
1 診斷病毒病
1.1 禽流感
禽流感病毒變異極為頻繁，血清亞型眾多,，已報(bào)道的有15種血凝素HA亞型（H1～H15）和9種神經(jīng)氨酸酶NA亞型（N1～N9）,。禽流感病毒呈性分布，絕大多數(shù)禽流感病毒呈隱性感染,，不表現(xiàn)臨床癥狀,，只有少數(shù)禽流感病毒具有迅速傳播和高致病性的特性。外檢測(cè)禽流感病毒的方法是OIE的雞胚病毒分離方法,，該方法約需要耗時(shí)21 d,，不適合禽類進(jìn)出口的檢疫和發(fā)生疫情時(shí)的及時(shí)診斷。張鶴曉等[1]根據(jù)A型流感病毒的核酸保守區(qū)共有序列,，開發(fā),、設(shè)計(jì)多條引物和探針序列，從中篩選敏感,、特異的引物和探針,，在循環(huán)參數(shù)、病毒核酸的提取方法,、反轉(zhuǎn)錄條件的基礎(chǔ)上,，建立了快速的通用型“一步法”檢測(cè)所有A型流感病毒的通用型熒光RT-PCR。該方法與雞胚病毒分離相比,，敏感性基本一致,，可直接用來檢測(cè)泄殖腔、喉拭子和禽肉,，將檢測(cè)時(shí)間從原來的21 d縮短為4 h,。朱文斯等[2]根據(jù)禽流感病毒H5亞型的RNA 4節(jié)段設(shè)計(jì)了檢測(cè)禽流感病毒H5亞型的引物和探針，其敏感性高能達(dá)到10-7,，該方法特異性強(qiáng),，與傳染性法氏囊病毒中等毒力及弱毒疫苗、新城疫弱毒疫苗,、傳染性支氣管炎弱毒疫苗,、鴨瘟弱毒疫苗、鴨病毒性肝炎弱毒疫苗及有可能感染的禽流感病毒H9亞型,、新城疫強(qiáng)毒,、雞傳染性貧血病毒均不反應(yīng)。
1.2 新城疫
新城疫病毒屬于副黏病毒,，根據(jù)毒株的致病力可分為強(qiáng)毒力型,、中等毒力型及弱毒力型,。OIE檢測(cè)新城疫病毒的方法是雞胚病毒分離方法，需要21 d,。張鶴曉等[3]建立的熒光RT-PCR方法不僅能將中強(qiáng)毒力新城疫病毒與弱毒區(qū)分開來,，而且不與常見的禽類病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，其敏感性高可達(dá)10-7,。楊德勝等[4]利用熒光RT-PCR方法對(duì)910份樣品進(jìn)行新城疫病毒檢測(cè),，陽性30份，并用雞胚分離部分檢測(cè)樣品,，結(jié)果一致,。說明了熒光RT-PCR方法檢測(cè)新城疫病毒具有敏感、特異,、快速,、、安全等特點(diǎn),。
1.3 口蹄疫
口蹄疫是一種危害偶蹄動(dòng)物的烈性傳染病,，被OIE列為A類動(dòng)物傳染病?？谔阋叩谋┌l(fā)曾經(jīng)給許多國(guó)家和地區(qū)的畜牧業(yè)及動(dòng)物貿(mào)易帶來災(zāi)難性的損失,。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科,，為單股正鏈，血清型復(fù)雜多變,，有7個(gè)血清型,，即O、A,、C,、SAT1、SAT2,、SAT3和Aasia1型,。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性和性都較差,，ELISA方法敏感性低,，常規(guī)RT-PCR在樣品進(jìn)行檢測(cè)的過程中容易被污染，以上方法難以適應(yīng)當(dāng)前口蹄疫防疫工作的要求,。建立一種快速和可靠的診斷方法,，對(duì)于控制和消滅口蹄疫至關(guān)重要?；ㄈ毫x等[5]根據(jù)口蹄疫病毒聚合酶3D基因片段非常保守的區(qū)域設(shè)計(jì)的引物,、探針,，擴(kuò)增區(qū)內(nèi)口蹄疫病毒 O型、A型,、C型,、Asia1型、SAT1～3型的序列相同,，引物和探針是通用的,，建立了熒光RT-PCR方法，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物,、水皰液,、水皰皮及分泌物進(jìn)行了檢測(cè)，得到了滿意的結(jié)果,，與其他水皰性病毒不發(fā)生交叉反應(yīng),。楊素等[6]應(yīng)用熒光RT-PCR技術(shù)，利用O型口蹄疫病毒的5′端UTR區(qū)的IRES片段設(shè)計(jì)和合成了可檢測(cè)7個(gè)血清型口蹄疫病毒群特異性引物和Taqman探針,，結(jié)果表明敏感性高,，特異性強(qiáng)，耗時(shí)僅為4 h,，克服了傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng),，敏感性和性較差，而且容易造成病毒擴(kuò)散及環(huán)境污染的缺點(diǎn),，適用于大批量樣品的快速檢測(cè),。
1.4 豬瘟
對(duì)豬瘟病毒的傳統(tǒng)診斷方法包括免疫熒光試驗(yàn)、細(xì)胞分離培養(yǎng),、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),、動(dòng)物接種試驗(yàn)等，這些方法都存在不足之處,。溫國(guó)元等[7]在豬瘟病毒高度保守的5′端非編碼區(qū)作為擴(kuò)增靶區(qū),，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物和一條Taqman探針，建立了熒光RT-PCR方法,，該方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10拷貝/μL,，對(duì)不同毒株以及各種組織樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽性，該方法比RT-PCR靈敏度高100倍,，與PCR具有相同的靈敏度,。陳玉棟等[8]在豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條熒光探針，結(jié)合Light Cycler檢測(cè)系統(tǒng),，建立了定量檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的方法,，該方法的靈敏度為100拷貝數(shù)，整個(gè)檢測(cè)過程僅需4 h,，該方法可望取代傳統(tǒng)的兔體定型反應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過程中的效價(jià)測(cè)定及指導(dǎo)疫苗的配制,，也為豬瘟病毒分子生物學(xué)研究提供了一種新的,、簡(jiǎn)捷有效的工具。
2 診斷細(xì)菌病
2.1 大腸埃希菌O157∶H7
大腸埃希菌O157∶H7是腸出血大腸埃希菌的一種主要血清型,，可引起人出血性結(jié)腸炎,、溶血性尿綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重并發(fā)癥。該菌主要通過食物傳播,，動(dòng)物是其主要的宿主,。近年來外各個(gè)實(shí)驗(yàn)室診斷大腸埃希菌O157∶H7的檢測(cè)方法不斷出現(xiàn)，其中有PCR方法,，多重PCR方法,，但這些方法檢測(cè)時(shí)間比較長(zhǎng)，檢測(cè)過程繁瑣,，不適合大規(guī)模動(dòng)物產(chǎn)品的檢測(cè),。Jothikumar N等[9]運(yùn)用一種復(fù)合式Sybr Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法快速測(cè)定大腸埃希菌O157∶H7，用一對(duì)特異引物同時(shí)擴(kuò)增大腸埃希菌O157∶H7的類志賀毒素（stx1或stx2）基因,。鑒于擴(kuò)增后產(chǎn)生的兩個(gè)PCR產(chǎn)物的Tm值不等,由此加以區(qū)別,。此方法操作簡(jiǎn)便，快速,，特異性好,。張險(xiǎn)朋等[10]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)大腸埃希菌O157∶H7菌株檢測(cè)為陽性，而大腸埃希菌O1∶H7,，O119,，O143及沙門菌無交叉反應(yīng)，證明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)大腸埃希菌O157∶H7的特異性強(qiáng),，快速,，適用于動(dòng)物產(chǎn)品快速檢測(cè)。
2.2 沙門菌
沙門菌的傳統(tǒng)鑒定方法是挑取單個(gè)菌落進(jìn)行生化方面的試驗(yàn),，而后利用血清凝集試驗(yàn)進(jìn)行分型，由于方法本身的特異性問題而使鑒定的性和靈敏度較差,，而且耗費(fèi)的時(shí)間,。趙雪濤等[11]根據(jù)沙門菌GenBank Accession NO U25352基因序列,設(shè)計(jì)并合成引物和Taqman探針，將PCR擴(kuò)增的沙門菌基因片段克隆導(dǎo)入載體,構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)篩選,、鑒定后,作為陽性模板,用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定,。利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行各類菌株的定性鑒定。應(yīng)用重組質(zhì)粒制作的定量曲線,其循環(huán)閾值與模板濃度的對(duì)數(shù)值具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.999,。檢測(cè)各類菌株,其中沙門菌41株,、H抗原丟失的沙門菌16株均呈陽性;非沙門菌109株均呈陰性。證明建立的沙門菌的熒光定量PCR方法簡(jiǎn)便,、快速,、,。
2.3 炭疽芽孢桿菌
炭疽是由炭疽芽孢桿菌引起的人獸共患病，炭疽芽孢在環(huán)境中抵抗力*,，在軍事上一直被列為*生物戰(zhàn)劑,，快速檢驗(yàn)和鑒定炭疽芽孢桿菌無論對(duì)人和草食動(dòng)物炭疽病診斷，還是應(yīng)對(duì)可能出現(xiàn)的生物恐怖襲擊都十分重要,。李偉等[12]采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),，以pXO1質(zhì)粒上的pag基因、pXO2質(zhì)粒上的cap基因及染色體上的ropB基因設(shè)計(jì)引物和探針,，應(yīng)用上述基因探針的外標(biāo)對(duì)照,、pagA基因的內(nèi)標(biāo)對(duì)照等技術(shù)建立一種快速、,、特異,、定性、定量檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的方法,。陳蘇紅等[13]以pXO1質(zhì)粒上的pag基因及pXO2質(zhì)粒上的cap基因?yàn)榘泻铣商禺愐?/span>,用DNA嵌入熒光染料SYBR GreenⅠ進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,在PCR后進(jìn)行熔解曲線分析,，以確定得到的產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物。該方法檢測(cè)炭疽芽孢桿菌的靈敏度達(dá)1 000拷貝,。
2.4 胸膜肺炎放線桿菌
豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）有2個(gè)生物亞型和15個(gè)血清型,，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有血清學(xué)方法和常規(guī)PCR方法，均存在不足之處,。李樹清等[14]根據(jù)APP apxⅣA毒素基因的序列設(shè)計(jì)了引物和探針,，建立實(shí)時(shí)熒光PCR方法并初步應(yīng)用，在150份樣品中檢出APP陽性23份,。
3 診斷寄生蟲病
王頻佳等[15]利用擴(kuò)增的弓形蟲529 bp重復(fù)序列,經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α中;提取重組質(zhì)粒鑒定后,作為模板建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,并做重復(fù)性試驗(yàn)和臨床標(biāo)本檢測(cè),，用重組質(zhì)粒制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.995,試驗(yàn)間變異系數(shù)平均為3.28%,無非特異性擴(kuò)增，樣品檢測(cè)陽性率為43.3%,。建立了檢測(cè)弓形蟲基因的熒光定量方法,具有快速,、靈敏、特異的特點(diǎn),。Woo T H等[16]以Light Cycler TM為平臺(tái),，利用SYBR GreenⅠ作為熒光染料，建立了一種鑒定鉤端螺旋體的實(shí)時(shí) PCR方法,目標(biāo)片段為16S rRNA,利用熔點(diǎn)曲線分析來區(qū)別特異產(chǎn)物,、引物二聚體和非特異性產(chǎn)物,不需要電泳來鑒定,該方法快速而敏感,整個(gè)過程在20 min內(nèi)完成,。James A H等[17]用以ABIPrism7700SDS為平臺(tái)，應(yīng)用Taqman探針建立了從小牛腹瀉糞便中定量檢測(cè)小隱孢子蟲cp11基因和18S rRNA的實(shí)時(shí)熒光PCR方法,。
4 展望
由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量,，此技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中,，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR解決了雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng),，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí),，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著[18-19]。由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的,，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo),。正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo),，但仍然只是一種半定量的方法,。美國(guó)Texas大學(xué)的科研人員經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)論是,，內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的,，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種的、值得信賴的科學(xué)方法[20],。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)作為一種新的檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的診斷,。目前，在動(dòng)物疫病的診斷上,，現(xiàn)已發(fā)展到至少有15種實(shí)時(shí)熒光PCR方法,。市場(chǎng)上也出現(xiàn)一些動(dòng)物疫病診斷的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒。雖然實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)成本比較高,，實(shí)時(shí)熒光PCR儀比較昂貴,，但隨著實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的進(jìn)一步普及和發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的進(jìn)一步開發(fā),，以及它具有比傳統(tǒng)病原學(xué),、血清學(xué)和常規(guī)的PCR更敏感、特異,、無污染等優(yōu)點(diǎn),，此技術(shù)將會(huì)在動(dòng)物疫病診斷中得到更加廣泛的應(yīng)用。
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