• 在精子卵子授精后14-19小時期間觀察原核。
• 操作環(huán)境：百級凈化環(huán)境中操作,，配備溫度37℃加熱板的體視鏡下觀察,。
• 挑選合適尖吸管用于剝離“受精卵”外層卵丘細胞（可實驗自制或者購買剝卵針），尖吸管內直徑稍微大于卵母細胞的直徑,。使用尖吸管前請在體視鏡觀察尖吸管頭部是否完好和內直徑是否合適（管內直徑120微米左右）,。
• 取卵當日為每個IVF/ICSI患者準備胚胎培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿周圍用卵裂液（如G1,，或Gm）做8-10個微滴,，中間3-4個微滴備沖洗，每個胚胎培養(yǎng)微滴用液約15ul,，其上蓋滿 礦物油,。將準備好的胚胎培養(yǎng)皿放入CO2 培養(yǎng)箱內平衡通宵。
• 了解患者通宵精子的情況：如未提示通宵精子培養(yǎng)液中未見較多密集的顆粒狀物,，可以開始觀察原核操作,；如提示通宵精子培養(yǎng)液中可見較多密集的顆粒狀物，可能發(fā)生“受精卵”污染,，請zui后觀察,，具體操作見補充說明。
• 準備以上條件后,，從培養(yǎng)箱取出患者授精的4孔培養(yǎng)皿,，與實驗室記錄單核對夫妻雙方名字及核對所觀察的的“卵子”數目。
• RT受精卵的原核檢查,，需先剝除外層卵丘細胞,。使用前尖吸管可用授精培養(yǎng)液體潤洗下。體視鏡下,，尖吸管在授精孔吹吐“受精卵”,，剝離“受精卵”外層卵丘細胞。開始時,，先剝離一個“受精卵”,，如順利，之后可以3-4個受精卵一起剝離,。
• 原核檢查：剝離顆粒細胞后,，使用尖吸管將卵母細胞轉入備好的胚胎培養(yǎng)皿內（ICSI受精卵直接轉入胚胎培養(yǎng)皿內）,，在體視鏡下（80X）進行原核觀察，如解剖鏡下顯示不清需在倒置鏡下（200X）下觀察,。
• 將受精卵在中間3個培養(yǎng)滴進行清洗后,，按2PN，1PN,，0PN（無原核,，可為2pb，MII）,，MI,，GV，3PN/多PN（3個以上原核）等受精情況情況進行分類放置,，每個培養(yǎng)滴放1-5枚胚胎（如果胚胎數超過30建議使用2個及以上培養(yǎng)皿）,。標記核對患者夫妻雙方名字于胚胎培養(yǎng)的小皿，與患者四孔培養(yǎng)皿一直放入培養(yǎng)箱,，位置與原來相同,。作好受精情況記錄，記錄包括受精情況,，位置,，培養(yǎng)液，觀察時間,，操作者,。
• 如果“受精卵”剝離和觀察是在空氣環(huán)境下，此操作過程不能超過十分鐘,。
• 一位患者受精觀察結束后銷毀使用過的尖吸管,，開始下一位患者的觀察。

補充說明

1．常規(guī)受精失敗或常規(guī)受精率低于20%：觀察未受精卵成熟情況,；了解通宵精子的情況,，及四孔精子情況，判斷是否補救ICSI,，和是否發(fā)生污染,。

2．補救ICSI：如果常規(guī)受精失敗，或受精率低于20%,。

●原則是盡可能保證患者有一次胚胎移植機會,。

●常規(guī)受精*失敗視卵成熟情況和卵子質量好壞決定是否進行補救ICSI。

●受精率低于20%：

如果正常受精2PN≥2,，受精卵形態(tài)正常,，可以考慮不補救ICSI。

如果正常受精2PN＜2，且有5個以上正常形態(tài)MII,，建議補救ICSI,。

●及時補救ICSI。

●如補救,，第二天請先觀察補救ICSI受精情況,。

3．污染問題：

污染提示：

• 通宵精子培養(yǎng)液中見較多密集的顆粒狀物。
• 受精的4孔培養(yǎng)液有渾濁的情況發(fā)生,。
• 常規(guī)受精*沒有受精,。

污染觀察：倒置顯微鏡下（200X或400X）下觀察確認。

污染處理：*種情況: 4孔培養(yǎng)液中布滿大量的顆粒狀物,，精子大多數不活動,，顆粒細胞貼壁生長差，可以當日行精液及胚胎培養(yǎng)液的細菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實驗

第二種情況:如上述情況不是很明顯,，到D3移植日再觀察決定。這種情況下如果常規(guī)*未受精可以行補救ICSI,。

D3觀察：●胚胎培養(yǎng)滴中未發(fā)現顆粒,，移植。

 ●胚胎培養(yǎng)滴中發(fā)現顆粒,，不移植,，精液及胚胎培養(yǎng)液的細菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實驗。

 ●胚胎培養(yǎng)滴中難以確定顆粒,，囊胚培養(yǎng)后決定,？胚胎冷凍，胚胎胚胎培養(yǎng)液的細菌培養(yǎng)鑒定,？ 

初步判斷污染來源：

●提示精子來源污染,；

通宵精子培養(yǎng)液有明顯大量顆粒，培養(yǎng)卵母細胞的四孔中間背景干凈,，浸洗卵母細胞培養(yǎng)皿背景干凈,。

●提示卵子來源污染；通宵精子培養(yǎng)液未見較多密集的顆粒狀物,，且精子活力良好,，培養(yǎng)卵母細胞的四孔中間可見較多密集的顆粒狀物，浸洗卵母細胞培養(yǎng)皿背景可見較多密集的顆粒狀物,。

補充

1．常規(guī)受精失敗或常規(guī)受精率低于20%：觀察未受精卵成熟情況,；了解精子的情況，及四孔精子情況,，判斷是否補救ICSI,，和是否發(fā)生污染。

2．補救ICSI：如果常規(guī)受精失敗，或受精率低于20%,。

●原則是盡可能保證患者有一次胚胎移植機會,。

●常規(guī)受精*失敗視卵成熟情況和卵子質量好壞決定是否進行補救ICSI。

●受精率低于20%：

如果正常受精2PN≥2,，受精卵形態(tài)正常,，可以考慮不補救ICSI。

如果正常受精2PN＜2,，且有5個以上正常形態(tài)MII,，建議補救ICSI。

●及時補救ICSI,。

●如補救,，第二天請先觀察補救ICSI受精情況。

3．污染問題：

污染提示：

• 精子培養(yǎng)液中見較多密集的顆粒狀物,。
• 受精的4孔培養(yǎng)液有渾濁的情況發(fā)生,。
• 常規(guī)受精*沒有受精。

污染觀察：倒置顯微鏡下（200X或400X）下觀察確認,。

污染處理：*種情況: 4孔培養(yǎng)液中布滿大量的顆粒狀物,，精子大多數不活動，顆粒細胞貼壁生長差,，可以當日行精液及胚胎培養(yǎng)液的細菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實驗

第二種情況:如上述情況不是很明顯,，到D3移植日再觀察決定。這種情況下如果常規(guī)*未受精可以行補救ICSI,。

D3觀察：●胚胎培養(yǎng)滴中未發(fā)現顆粒,，移植

●胚胎培養(yǎng)滴中發(fā)現顆粒，不移植,，精液及胚胎培養(yǎng)液的細菌培養(yǎng)鑒定及藥敏實驗,。

●胚胎培養(yǎng)滴中難以確定顆粒，囊胚培養(yǎng)后決定,？胚胎冷凍,，胚胎胚胎培養(yǎng)液的細菌培養(yǎng)鑒

 初步判斷污染來源：

●提示精子來源污染；

精子培養(yǎng)液有明顯大量顆粒,，培養(yǎng)卵母細胞的四孔中間背景干凈,，浸洗卵母細胞培養(yǎng)皿背景干凈。

●提示卵子來源污染,；精子培養(yǎng)液未見較多密集的顆粒狀物,，且精子活力良好，培養(yǎng)卵母細胞的四孔中間可見較多密集的顆粒狀物,，浸洗卵母細胞培養(yǎng)皿背景可見較多密集的顆粒狀物,。