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支原體污染檢測(cè)試劑盒（PCR法）說(shuō)明-上海哈靈
閱讀：1269 發(fā)布時(shí)間：2013-8-10上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒（PCR法）-上海哈靈
（PCR Mycoplasma Detection Kit）
Cat number：YS012
Store at -20℃ for one year
Expire date：
For Research Use Only
（PCR Mycoplasma Detection Kit）
Cat number：YS012
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For Research Use Only
一、 上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒說(shuō)明：
本試劑盒經(jīng)過(guò)PCR法對(duì)細(xì)胞培育物,、動(dòng)物分泌物等多種生物資料進(jìn)行支原體污染檢測(cè),。常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行支原體檢測(cè)通常需求幾天的時(shí)間,，而本試劑盒經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及電泳分析進(jìn)行支原體檢測(cè)只需要幾個(gè)小時(shí)，既方便又快捷,。本試劑盒的多對(duì)引物能特異性擴(kuò)增多種支原體rRNA基因片段,，一次就能夠檢測(cè)至少11種的支原體,，包含M. fermentans，M. hyorhinis,，M. arginini,，M. orale，M. salivarium,，M. hominis,，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等,。其原理是原核生物的rRNA堿基序列十分保守,，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列不一樣很大,。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分,，也有具有很大區(qū)別的部分。因而能夠在編碼16S和23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)引物,，擴(kuò)增編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū),，然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條引物進(jìn)行嵌套式PCR,。能特異性檢測(cè)出支原體DNA,，檢測(cè)靈敏度與特異性都很高。
本試劑盒經(jīng)過(guò)PCR法對(duì)細(xì)胞培育物,、動(dòng)物分泌物等多種生物資料進(jìn)行支原體污染檢測(cè),。常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行支原體檢測(cè)通常需求幾天的時(shí)間,，而本試劑盒經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及電泳分析進(jìn)行支原體檢測(cè)只需要幾個(gè)小時(shí)，既方便又快捷,。本試劑盒的多對(duì)引物能特異性擴(kuò)增多種支原體rRNA基因片段,，一次就能夠檢測(cè)至少11種的支原體,，包含M. fermentans，M. hyorhinis,，M. arginini,，M. orale，M. salivarium,，M. hominis,，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等,。其原理是原核生物的rRNA堿基序列十分保守,，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列不一樣很大,。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分,，也有具有很大區(qū)別的部分。因而能夠在編碼16S和23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)引物,，擴(kuò)增編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū),，然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條引物進(jìn)行嵌套式PCR,。能特異性檢測(cè)出支原體DNA,，檢測(cè)靈敏度與特異性都很高。
二,、上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒組份：
組份 012（20 assays） 貯存條件 10×Taq Buffer（不含Mg2＋） 1.0 mL -20℃ MgCl2（25mM） 1.0 mL -20℃ Taq DNA Polymerase（5 U /μl） 100 U -20℃ Myc F1 Primer （10μM） 50μL -20℃ Myc R1 Primer（10μM） 50μL -20℃ Myc F2 Primer（10μM） 50μL -20℃ Myc R2 Primer（10μM） 50μL -20℃ Control Template（1 ng/μl） 50μL -20℃ DNA溶解液 2 mL -20℃ ddH2O 5 mL -20℃
組份 012（20 assays） 貯存條件 10×Taq Buffer（不含Mg2＋） 1.0 mL -20℃ MgCl2（25mM） 1.0 mL -20℃ Taq DNA Polymerase（5 U /μl） 100 U -20℃ Myc F1 Primer （10μM） 50μL -20℃ Myc R1 Primer（10μM） 50μL -20℃ Myc F2 Primer（10μM） 50μL -20℃ Myc R2 Primer（10μM） 50μL -20℃ Control Template（1 ng/μl） 50μL -20℃ DNA溶解液 2 mL -20℃ ddH2O 5 mL -20℃
三,、試劑盒以外自備儀器和試劑
電泳儀、離心機(jī),、PCR儀,、凝膠成像儀、微量移液器,、dNTPs（10mM）,、瓊脂糖、溴化乙錠等
四,、運(yùn)用注意事項(xiàng)
整個(gè)試驗(yàn),，必須標(biāo)準(zhǔn)操作，反應(yīng)系統(tǒng)的配置,、樣本處置及加樣,、PCR擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染,。
電泳儀、離心機(jī),、PCR儀,、凝膠成像儀、微量移液器,、dNTPs（10mM）,、瓊脂糖、溴化乙錠等
四,、運(yùn)用注意事項(xiàng)
整個(gè)試驗(yàn),，必須標(biāo)準(zhǔn)操作，反應(yīng)系統(tǒng)的配置,、樣本處置及加樣,、PCR擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染,。
上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒操作方法：
1.收取待檢樣品（細(xì)胞通常成長(zhǎng)至80％左右即可,，貼壁細(xì)胞不宜用消化液消化細(xì)胞，可以運(yùn)用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞），然后取細(xì)胞懸液200ul（約1～3×105細(xì)胞數(shù)）至離心管,，12000rpm離心5～10min,；去除上清，加入50ul DNA溶解液,，充分懸浮沉淀物,，沸水浴5min；樣品運(yùn)用前12000rpm離心5～10min,，取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板,；剩下樣品能夠-20℃保藏。樣本有時(shí)也能夠直接用污染液直接做PCR反應(yīng),。
上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)：
*步PCR：
50μL系統(tǒng)PCR反應(yīng)（如客戶需求運(yùn)用更小量的反應(yīng)系統(tǒng),，試劑加樣量按份額進(jìn)行削減）：
（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s,；
（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管,，在冰上順次參加
1.收取待檢樣品（細(xì)胞通常成長(zhǎng)至80％左右即可,，貼壁細(xì)胞不宜用消化液消化細(xì)胞，可以運(yùn)用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞），然后取細(xì)胞懸液200ul（約1～3×105細(xì)胞數(shù)）至離心管,，12000rpm離心5～10min,；去除上清，加入50ul DNA溶解液,，充分懸浮沉淀物,，沸水浴5min；樣品運(yùn)用前12000rpm離心5～10min,，取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板,；剩下樣品能夠-20℃保藏。樣本有時(shí)也能夠直接用污染液直接做PCR反應(yīng),。
上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)：
*步PCR：
50μL系統(tǒng)PCR反應(yīng)（如客戶需求運(yùn)用更小量的反應(yīng)系統(tǒng),，試劑加樣量按份額進(jìn)行削減）：
（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s,；
（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管,，在冰上順次參加
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs （10mM） 1 μL
MgCl2 （25mM） 4 μL
Myc F1 （10μM） 1 μL
Myc R1 （10μM） 1 μL
DNA樣品 1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s,；
（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增條件：
94°C,，5min；
94°C,，30 sec,；55°C，2min,；72°C,，1 min；32 Cycles,；
72°C，10 min,，
dNTPs （10mM） 1 μL
MgCl2 （25mM） 4 μL
Myc F1 （10μM） 1 μL
Myc R1 （10μM） 1 μL
DNA樣品 1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s,；
（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增條件：
94°C,，5min；
94°C,，30 sec,；55°C，2min,；72°C,，1 min；32 Cycles,；
72°C，10 min,，
第二步PCR：
50μL系統(tǒng)PCR反應(yīng)（如客戶需求運(yùn)用更小量的反應(yīng)系統(tǒng),，試劑加樣量按份額進(jìn)行削減）：
（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s,；
（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管,，在冰上順次加入
50μL系統(tǒng)PCR反應(yīng)（如客戶需求運(yùn)用更小量的反應(yīng)系統(tǒng),，試劑加樣量按份額進(jìn)行削減）：
（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s,；
（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管,，在冰上順次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs （10mM） 1 μL
MgCl2 （25mM） 4 μL
Myc F2 （10μM） 1 μL
Myc R2 （10μM） 1 μL
*步產(chǎn)品 1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s,；
（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增條件：
94°C,，5min；
94°C,，30 sec,；55°C，2min；72°C,，1 min,；32 Cycles；
72°C,，10 min,，
3.反應(yīng)完畢后，取反應(yīng)液10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，承認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)品,。若是此PCR產(chǎn)品需用于今后試驗(yàn)，應(yīng)將PCR產(chǎn)品冷凍保管,。
4.依據(jù)感染支原體類型的不一樣,，擴(kuò)增產(chǎn)品大小有所不一樣，*步PCR產(chǎn)品在350～700bp 之間,，第二步PCR產(chǎn)品在150～250bp之間,。
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）
TRAP-PCR端粒酶活性檢測(cè)試劑盒
dNTPs （10mM） 1 μL
MgCl2 （25mM） 4 μL
Myc F2 （10μM） 1 μL
Myc R2 （10μM） 1 μL
*步產(chǎn)品 1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s,；
（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增條件：
94°C,，5min；
94°C,，30 sec,；55°C，2min；72°C,，1 min,；32 Cycles；
72°C,，10 min,，
3.反應(yīng)完畢后，取反應(yīng)液10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，承認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)品,。若是此PCR產(chǎn)品需用于今后試驗(yàn)，應(yīng)將PCR產(chǎn)品冷凍保管,。
4.依據(jù)感染支原體類型的不一樣,，擴(kuò)增產(chǎn)品大小有所不一樣，*步PCR產(chǎn)品在350～700bp 之間,，第二步PCR產(chǎn)品在150～250bp之間,。
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）
TRAP-PCR端粒酶活性檢測(cè)試劑盒
以上信息為上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒的詳細(xì)內(nèi)容！