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大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2酶聯(lián)免疫分析說(shuō)明書(shū)
閱讀：1163 發(fā)布時(shí)間：2013-8-22| 提 供 商 | 上海哈靈生物科技有限公司 | 資料大小 | 5.3KB |
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目的：研究使用此試劑本試劑盒測(cè)定大鼠血清,，血漿，
基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）含量的上清液樣品,。
實(shí)驗(yàn)原理：
大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)樣品,，本試劑盒的雙抗體夾心法（MMP-2）水平的2。與純
大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，單克隆抗體的多孔涂層
基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2），然后加入MMP-2抗體,、HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合,，形成
抗體復(fù)合物酶與底物TMB顯色，*清洗后,。TMB HRP催化酶轉(zhuǎn)化
在酸的作用下進(jìn)入決賽的黃色,?；|(zhì)金屬蛋白酶的顏色深度和樣品中的2（MMP
正相關(guān)。測(cè)得的吸光度在450nm波長(zhǎng)與ELISA（OD值）,，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品
基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）濃度,。
試劑盒組成：
試劑盒組成48孔配置96孔配置保
說(shuō)明書(shū)1份1份
封板膜2片（48）2片（96）
密封袋1個(gè)1個(gè)
酶標(biāo)包被板1×481×962-8℃保
標(biāo)準(zhǔn)品：450μg/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保
酶標(biāo)試劑3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保
樣本處理及要求：
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收
清,，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。
2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，
20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該
離心,。
3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。
4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-30
分）。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，
濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20
鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。
5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?/div>
用,。標(biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待
檢測(cè),，其余冷凍備用。
6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7.不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性,。
操作步驟：
1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,，在*、第二孔中分別加標(biāo)
準(zhǔn)品100μl,，然后在*,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻,；然后從*孔,、第二
孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，
混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五,、第六孔
中，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各
取50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混
勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)
品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，
濃度分別為300μg/L,，200μg/L，100μg/L,，50μg/L,，25μg/L）。
2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、待測(cè)樣
品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣
品終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混
勻,。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。
5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此
重復(fù)5次,，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5,。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色
15分鐘.
10.終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）,。測(cè)定應(yīng)在加終止
液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未
用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間
控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)
算時(shí)請(qǐng)后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。
6．底物請(qǐng)避光保存,。
7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。
10.如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),。
計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo)，
在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)OD樣品
從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度值乘以稀釋,；
多；或與標(biāo)準(zhǔn)濃度與標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程,，樣本的OD值
方程,，計(jì)算樣品濃度，再乘以稀釋
多,，為樣品的實(shí)際濃度
?。ù藞D僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和11%
檢測(cè)范圍：
20μg/L-400μg/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：,；2-8℃,。
2．有效期：6個(gè)月