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1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,，4℃ ,。次日，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次,，每次3分鐘。（簡稱洗滌,，下同）,。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時,。然后洗滌,。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）,。
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時,，洗滌,。
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘,。
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強,，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+",、“-"號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色,，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性,。
 
間接法
1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml,，4℃,；
2.次日洗滌3次；
3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌,；
4.（同時做空白,、陰性及陽性孔對照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml,；
5.37℃孵育35-60分鐘,，洗滌；
6.’后一遍用DDW洗滌,。
其余步驟同“雙抗體夾心法"的4,、5、6,。