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ELISA技術(shù)之酶標儀
閱讀:1417 發(fā)布時間:2015-1-19為微孔板比色計的酶標儀,,其基本功能不外乎一個比色測定,,所不同的是在測定波長范圍、吸光度范圍,、光學系統(tǒng),、檢測速度、震板功能,、溫度控制,、定性和定量測定軟件功能等方面的差異,當然全自動酶免疫分析系統(tǒng)還具有自動洗板,、溫育,、加樣等功能。在臨床實驗室實際工作中,,實驗人員在使用酶標儀進行測定操作時,,有時難免會對酶標儀的一些性能指標產(chǎn)生迷惑,甚至對酶標儀的應(yīng)用產(chǎn)生錯誤的理解,。如諸如使用酶標儀較用肉眼觀察測定的陽性率明顯增加這樣的問題,。
測定波長目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)。底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD),,其在過氧化氫溶液的存在下,,經(jīng)HRP作用,分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌,。當pH值為5.0左右時,,DAB在450nm波長處有大吸收,當pH值降為L 0時,,大吸收波長移至492 nm,同時摩爾消光系數(shù)變大,,顯色加深,因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng),。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有大消光系數(shù),,如果HRP量少,H:O:和TMB過量時,,則形成藍色的陽離子根,。降低pH,即可使藍色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌,使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min.因此,,450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定常用的,。
各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉(zhuǎn)換的部件,,可以同時安裝6~8片濾光片,所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個波長,,有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片,,影響不大 一般酶標儀的測定波長在400~750nm或800nm之間,*可以滿足ELISA的顯色測定,。