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細(xì)胞培養(yǎng)的小竅門(mén)
閱讀：1131 發(fā)布時(shí)間：2014-12-311.不同的細(xì)胞，喜歡的環(huán)境是不一樣的,。
這個(gè)不僅僅是說(shuō)培養(yǎng)基的不同,，還有就是細(xì)胞生長(zhǎng)的空間密度問(wèn)題,。
有一些細(xì)胞是數(shù)量多一點(diǎn)比較好生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)也比較好,。這種一般是屬于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞,。譬如內(nèi)皮細(xì)胞。而有一些是細(xì)胞是數(shù)量少一點(diǎn)細(xì)胞狀態(tài)會(huì)生長(zhǎng)的比較好,，譬如巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞,。尤其是巨噬細(xì)胞，生長(zhǎng)速度非常得快,，貼壁速度很快,，所以傳代時(shí)就應(yīng)該留很少量的細(xì)胞，這樣細(xì)胞狀態(tài)會(huì)比較好,。并且巨噬細(xì)胞比較喜歡扎堆生長(zhǎng),，而堆與堆之間是有空間的。如果長(zhǎng)成相連在一起的一滿片的時(shí)候,，細(xì)胞形態(tài)基本上就會(huì)差了,，老化的會(huì)比較多，對(duì)后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不好的,。所以在養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候應(yīng)該摸索該細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)空間密度問(wèn)題,。
2.對(duì)于有些人總是會(huì)遇到養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)怎么都不好的問(wèn)題。
這個(gè)其實(shí)是有一個(gè)方法可以改善的,。對(duì)于貼壁細(xì)胞,，如果細(xì)胞形態(tài)不好，（或者細(xì)胞形態(tài)不清晰,，表面似有異物等）可以在傳代的時(shí)候進(jìn)行如下操作：
首先,，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無(wú)血清的都可）洗滌一次,，用滴管吸走,，然后再加入3ml的培養(yǎng)基，進(jìn)行預(yù)吹打,，控制吹打力度,，輕輕地大概沿著瓶底過(guò)一遍，然后吸走,。這時(shí)侯再開(kāi)始正式的消化,、吹打。（巨噬細(xì)胞我們只吹打,，不消化的）
其次,，把吹打下來(lái)的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基,，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況。10分鐘觀察一次,，20分鐘,，30分鐘觀察一次。選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn),，已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁的情況下,，重新置于潔凈臺(tái)，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基,，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次,。然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及形態(tài),。
如果一次效果還不理想,，可重復(fù)多次。直到找到細(xì)胞形態(tài),。其中要注意,，結(jié)合細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)情況。喜歡多一點(diǎn)數(shù)量長(zhǎng)得好的細(xì)胞你就等貼壁細(xì)胞比較多點(diǎn)的時(shí)候再傳,。反之亦然,。
3.關(guān)于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入培養(yǎng)基的量的問(wèn)題。本文由上海哈靈生物科技有限公司提供
這個(gè)是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細(xì)胞的,。并不是小的玻璃方瓶12ml,，大方瓶14ml的。有些細(xì)胞反而是培養(yǎng)基少一點(diǎn)相反細(xì)胞形態(tài)會(huì)長(zhǎng)得比較好,。（可能也是競(jìng)爭(zhēng)很大,，有優(yōu)勝劣汰吧。）對(duì)于生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞,，易生長(zhǎng)的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好,。但是要注意換液掌握。
4.關(guān)于選擇培養(yǎng)瓶的問(wèn)題,。
生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞在玻璃瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的狀態(tài)會(huì)比一次性塑料瓶相對(duì)好一些,。而對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長(zhǎng)旺盛快速的時(shí)期在玻璃瓶?jī)?nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)也比塑料瓶?jī)?nèi)好,。這可能是因?yàn)樗芰掀勘炔Ａ扛菀踪N壁,。生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種相對(duì)“更安逸"的環(huán)境里反而長(zhǎng)得狀態(tài)不如玻璃瓶好。
所以對(duì)于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài),，塑料瓶比玻璃瓶會(huì)好,，對(duì)于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞，玻璃瓶則會(huì)更好,。同樣,，對(duì)于同一種細(xì)胞,，在其生長(zhǎng)速度慢的時(shí)候，塑料瓶會(huì)好一點(diǎn),，比如剛剛復(fù)蘇的時(shí)候,，或者原代培養(yǎng)的時(shí)候。而在其生長(zhǎng)旺盛的時(shí)候,，玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn),。
5.傳代時(shí)消化的問(wèn)題。
可以這樣說(shuō),，對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞,，每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否，狀態(tài)好與不好至關(guān)重要的考驗(yàn),。
很多同學(xué)都遇到過(guò)這個(gè)問(wèn)題,，自己養(yǎng)的細(xì)胞開(kāi)始的幾代長(zhǎng)的還挺好的，可是傳過(guò)幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞不行了,，狀態(tài)越來(lái)越差勁了,。對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，可以非?？隙ǖ卣f(shuō),，你的消化環(huán)節(jié)出問(wèn)題了。你每一次的消化都讓細(xì)胞受到較大損傷了,。所以,，越長(zhǎng)越差。
在消化的過(guò)程中,，你加入胰酶后,，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個(gè)問(wèn)題就是,，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是不一樣的,，每一個(gè)細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固,，有的貼壁沒(méi)有那么牢固的,，所以，讓所有的細(xì)胞消化同樣的時(shí)間對(duì)細(xì)胞是不公平的,，他們受到了差別待遇當(dāng)然會(huì)有脾氣啊,。。,。
具體操作：
1）.首先不加胰酶,，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗1-2遍，（這是前奏,，即為*步,，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉,。
2）.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來(lái),。再用培養(yǎng)基洗一遍,，兩次所得懸液混合傳入新瓶。即為第二步（你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng),，以與后面胰酶消化過(guò)的細(xì)胞對(duì)比觀察看誰(shuí)長(zhǎng)的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度了。）
3）.吸干凈瓶?jī)?nèi)剩余液體,，加入0.3ml左右的胰酶潤(rùn)洗一遍,，吸掉棄之，再加入1ml左右的胰酶消化,。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開(kāi)始吹打,，吹打2-3遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存,。用2ml左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。（你也可以傳入新瓶培養(yǎng),，以與后面及前面的做對(duì)比,。）這是第三步。
4）.然后把前面剛吸出來(lái)的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞,。當(dāng)然你也可以用新的胰酶,，如果你們那比較富裕的話。繼續(xù)鏡下觀察,，待剩余細(xì)胞間隙明顯,，細(xì)胞獨(dú)立開(kāi)來(lái)的時(shí)候，吸掉胰酶,，加入新培養(yǎng)基吹打,。懸液傳入新瓶培養(yǎng)（根據(jù)實(shí)際情況你自己把握）。這是第四步,。
其實(shí)還可以有第五步,，對(duì)于特別難消化的細(xì)胞和對(duì)胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步,。為了細(xì)胞更好的狀態(tài),，更漂亮的樣子，沒(méi)辦法,，你必須分多批多次消化,，這樣才能大限度地將胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷降到低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠優(yōu),。
當(dāng)然了,，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞,，像RAW264.7，僅僅第二步就搞定了,。就沒(méi)必要第三步第四步了,。這個(gè)是需要你在實(shí)驗(yàn)中能夠自己用心去體會(huì)的。建議你接受一個(gè)新細(xì)胞時(shí)把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來(lái)做比較,，去摸索好細(xì)胞對(duì)胰酶的要求,。便于你后續(xù)實(shí)
驗(yàn)的開(kāi)展。
將細(xì)胞消化分成這幾步,，除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外,，還有一個(gè)更重要的作用就是，可以大程度地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài),，不成片不連體,。
因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)候肯定是要相互，大部分的細(xì)胞都是要成片生長(zhǎng)的,，尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞,，單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長(zhǎng)著長(zhǎng)著就長(zhǎng)到一片去了。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話,，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的,，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡。所以,，消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài),，這個(gè)是非常考究你的功夫的,！
細(xì)胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個(gè),，因?yàn)樗麤](méi)有受力點(diǎn)了。很難找到受力點(diǎn)讓你對(duì)他吹打的力分散開(kāi)細(xì)胞,。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開(kāi),，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴(yán)格控制好消化的程度啊,，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理啊,。既要消化到容易吹打下來(lái)，又不能太過(guò),，一吹就整片脫落,，要單個(gè)單個(gè)地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長(zhǎng)狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開(kāi),。這個(gè)是很重要的一點(diǎn),。尤其是對(duì)于某些細(xì)胞這一點(diǎn)就是他活去死的致命點(diǎn)。像Caco-2細(xì)胞就是如此。
另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿的時(shí)候才去消化傳代,。要在細(xì)胞長(zhǎng)到70%左右的時(shí)候就要傳代了,，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)中已經(jīng)有疊層生長(zhǎng)的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代。不能再拖了,。
6.關(guān)于換液傳代時(shí)候洗瓶的問(wèn)題,。
對(duì)于用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，你在洗的時(shí)候如果是用無(wú)血清1640去洗細(xì)胞在隨即后的幾次中會(huì)比用DMEM洗的長(zhǎng)的要好,。同樣,，用1640培養(yǎng)的也有這個(gè)現(xiàn)象。
如果不嫌麻煩的話,，可以用PBS來(lái)洗,，洗的效果和用無(wú)血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對(duì)于有些細(xì)胞會(huì)更勝*,。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清，防止它對(duì)胰酶的影響,。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先,，是很關(guān)鍵的一點(diǎn)。
再補(bǔ)充一點(diǎn)：
傳代時(shí)PBS洗是很重要的一步,，近發(fā)現(xiàn),，用PBS就可以把細(xì)胞消化開(kāi)來(lái)。加入PBS放置10-15分鐘,，有些需要更長(zhǎng)的時(shí)間,，等到細(xì)胞一個(gè)個(gè)分離開(kāi)來(lái)的時(shí)候，就可以直接吹打下來(lái),，但是和胰酶消化一樣,，要控制好時(shí)間，不能時(shí)間太過(guò)了,，要不然損傷細(xì)胞,，細(xì)胞不容易成活，狀態(tài)容易不好,。這個(gè)方法對(duì)于某些細(xì)胞是很管用的,。有些細(xì)胞用胰酶消化不容易消化成單個(gè)的時(shí)候，或者臨時(shí)沒(méi)有胰酶了,，可以選用此方法,。不過(guò)一定要試試，看是否適合你的細(xì)胞,。