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猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒使用說明書操作原理
閱讀：1544 發(fā)布時(shí)間：2013-8-14猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒使用說明書
目的：該試劑盒使用于檢測(cè)猴血清,，血漿及相關(guān)液體樣本中狂犬病毒（RV）。
猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理：該試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中猴狂犬病毒（RV）。用純化的猴狂犬病毒（RV）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，可以與樣品中狂犬病毒（RV）相結(jié)合，經(jīng)過洗滌去除未結(jié)合的抗體和其他成分后再和HRP標(biāo)記的狂犬病毒（RV）抗體想結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加入底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化為終的黃色,。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，與CUTOFF值進(jìn)行對(duì)比，從而判定標(biāo)本中猴狂犬病毒（RV）是否存在,。
猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒樣本處理和要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心月20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如果出現(xiàn)沉淀,，需要再次離心,。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心月20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如果有沉淀形成,，需要再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集,，離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如果有沉淀形成,，需要再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行,。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集。離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過程中如果有沉淀形成,，需要再次離心,。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍需保持在2-8℃,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用,。
6. 標(biāo)本采集后應(yīng)盡早進(jìn)行提取,，提取時(shí)要按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若果不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存，必須避免反復(fù)凍融,。
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒操作步驟：
1.編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔,、陽性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,。
2.加樣：分別在陰、陽性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照,、陽性對(duì)照50μl,。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸碰到孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻,。
3.溫育：用封板膜封板后防止在置于溫度為37℃的溫度下溫育30分鐘,。
4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。
7.溫育：同3。
8.洗滌：同5,。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl,，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘,。
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色）,。
11.測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。
猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒結(jié)果判定：
試驗(yàn)有效性：陽性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10臨界值（CUT OFF）,。
計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15陰性。
判定：1,、樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為狂犬病毒（RV）陰性陽性,。
2、樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為狂犬病毒（RV）陽性,。