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細(xì)胞膜流動(dòng)性（fluidity）PDA 熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
閱讀：1644 發(fā)布時(shí)間：2023-8-14主要用途
細(xì)胞膜流動(dòng)性（fluidity）PDA 熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)苯并芘癸酸熒光染料,，選擇性地與細(xì)胞膜整合，
并與之產(chǎn)生空間交互作用,，形成激基締合物,，其熒光散發(fā)波長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移，即熒光比值的增強(qiáng)或減弱,，來(lái)分析
膜流動(dòng)性的而經(jīng)典的技術(shù)方法,。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的,。其適用于各種人體或動(dòng)物貼
壁或懸浮細(xì)胞膜流動(dòng)性的動(dòng)力學(xué)檢測(cè),。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用,，活體檢測(cè),，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)微管以及微絲的動(dòng)力學(xué)特征和微泡和囊泡內(nèi)脂質(zhì)的流動(dòng)動(dòng)力學(xué),，即流變學(xué)（rheological）細(xì)
胞功能,，受到細(xì)胞膜流動(dòng)性（fluidity）或粘性（viscosity）調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞膜酶系的活化,，微管和微絲的特
定裝配或流動(dòng),，化學(xué)引誘物受體親和力的強(qiáng)化，膜結(jié)構(gòu)和功能的作用等,。一旦調(diào)節(jié)失衡,，會(huì)導(dǎo)致病理演變
或膜性變異。苯并芘癸酸（pyrenedecanoic acid,；PDA）為多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbon）化
合物,，一種親脂性苯并芘熒光探針染料，用于膜生物物理學(xué)研究：第一,，具有親脂性,； 第二，與細(xì)胞膜脂
質(zhì)具有類(lèi)似性（analog）,，可以與細(xì)胞膜整合,；第三，進(jìn)入膜結(jié)構(gòu)空間后,，與之產(chǎn)生交互作用,，形成激基締
合物（eximer），其熒光散發(fā)波長(zhǎng)由372nm轉(zhuǎn)移到470nm,，通過(guò)締合物和單體的熒光比值（ratio）,，分析膜流
動(dòng)性強(qiáng)弱，包括動(dòng)力學(xué),，影響因子等,。
產(chǎn)品內(nèi)容
染色液（Reagent A）
微升
稀釋液（Reagent B）
毫升
清理液（Reagent C）
毫升
強(qiáng)化液（Reagent D）
微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
1 份
保存方式
保存清理液（Reagent C）在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里,；染色液（Reagent A）避免光照,；有
效保證 6 月
用戶(hù)自備
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離操作
細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞脫落操作
1.5 毫升離心管：用于樣品操作的容器
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光定性分析
比色皿或黑色 96 孔板：用于熒光定量分析的容器熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析
細(xì)胞流式儀：用于熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化,，稀釋液（Reagent B）
和強(qiáng)化液（Reagent D）放進(jìn) 25℃恒溫水槽里預(yù)熱,。然后分別移出 xx 微升染色液（Reagent A）和 xx 微升
強(qiáng)化液（Reagent D）到新的 1.5 毫升離心管，加入 980 微升稀釋液（Reagent B）,，混勻后,，在冰槽里靜置
（共 5 次操作量），并標(biāo)記為染色工作液,，放在暗室里,。然后進(jìn)行下列操作,。
一、直接法
1． 準(zhǔn)備 1 個(gè) 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞,，每孔鋪滿(mǎn)率達(dá) 70％（約 1 X 10 5細(xì)胞數(shù)）
2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
3． 輕輕沿著孔壁加入 xx 微升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔,，覆蓋培養(yǎng)孔表面
4． 小心抽去清理液（Reagent C）
5． 加入 xx 微升含有染色液（Reagent A）、稀釋液（Reagent B）和強(qiáng)化液（Reagent D）的染色工作液,，
覆蓋培養(yǎng)孔表面
6． 放進(jìn) 25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里,，孵育 20 分鐘（注意避光）
7． 小心抽去染色工作液
8． 小心加入 xx 微升清理液（Reagent C）
9． 小心抽去清理液（Reagent C）
10．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 8 至 9 一次
11．小心加入 xx 微升清理液（Reagent C）
12．選擇下列檢測(cè)：
一、 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察
1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 350nm,，散發(fā)波長(zhǎng) 370nm，干涉濾波器 405nm 波長(zhǎng) ）――
可見(jiàn)淺藍(lán)色熒光,；如果強(qiáng)度明顯,，表明膜流動(dòng)性減弱
2） 激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 350nm，散發(fā)波長(zhǎng) 470nm）――可見(jiàn)
深藍(lán)色熒光,；如果強(qiáng)度顯著減弱,，表明膜流動(dòng)性減弱
二、即刻在熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng) 350nm,，散發(fā)波長(zhǎng) 370nm 和 470nm）：獲得相對(duì)熒光單位
（relative fluorescence unit,；RFU）以及 RFU470/RFU370 的比值：比值高，膜流動(dòng)性強(qiáng)
二,、間接法
1． 準(zhǔn)備 1 個(gè) 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞,，每孔鋪滿(mǎn)率達(dá) 70％（約 2 X 10 6細(xì)胞數(shù)）
2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
3． 加入 xx 毫升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
4． 小心抽去 xx 毫升 清理液（Reagent C）
5． 加入 500 微升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,，鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)孔表面
6． 置入 37℃培養(yǎng)箱 1 分種
7． 輕輕抖動(dòng)培養(yǎng)板,，使細(xì)胞脫落，然后加入 1 毫升用戶(hù)自備的細(xì)胞培養(yǎng)液
8． 移入 1.5 毫升離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步開(kāi)始）
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9． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘,，速度為 1000g
10．小心抽去上清液
11．加入 xx 微升含有染色液（Reagent A）,、稀釋液（Reagent B）和強(qiáng)化液（Reagent D）的染色工作液
12．用 200 微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群
13．放進(jìn) 25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里,，孵育 20 分鐘（注意避光）
14．放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心 5 分鐘,，速度為 1000g
15．小心抽去上清液
16．加入 xx 微升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群
17．放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心 5 分鐘,，速度為 1000g
18．小心抽去上清液
19．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 16 至 18 一次
20．加入 xx 微升清理液（Reagent C）,，混勻細(xì)胞顆粒群
21．進(jìn)行下列檢測(cè)
選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀(guān)察
1． 混勻后,，移出 50 微升在載玻片上
2． 即刻進(jìn)行載玻片壓片,，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察：
1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng)350nm，散發(fā)波長(zhǎng)370nm,，干涉濾波器405nm 波長(zhǎng) ）――
可見(jiàn)淺藍(lán)色熒光,；如果強(qiáng)度明顯，表明膜流動(dòng)性減弱
2）激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 350nm，散發(fā)波長(zhǎng) 470nm）――可見(jiàn)
深藍(lán)色熒光,；如果強(qiáng)度顯著減弱,，表明膜流動(dòng)性減弱
選擇二、細(xì)胞流式儀分析
1. 混勻后,，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：觀(guān)察 5000 個(gè)細(xì)胞以上
激發(fā)波長(zhǎng)
360nm
熒光顏色
藍(lán)色
散發(fā)波長(zhǎng)
單體波長(zhǎng) 400nm 和締合物波長(zhǎng) 450nm
（70nm 波寬）
熒光變化
建立象限圖/散點(diǎn)圖
選擇三,、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定
1． 混勻后，移出 100 微升到黑色 96 孔板里或 100 微升比色皿里
2． 即刻進(jìn)行熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng) 350nm,，散發(fā)波長(zhǎng) 370nm 和 470nm）：獲得相
對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit,；RFU）以及 RFU470/RFU370 的比值：比值高，膜流動(dòng)性強(qiáng)
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為 20 次（0.2 毫升工作液）操作2． 操作時(shí),，須戴手套
3． 待測(cè)細(xì)胞建議不要過(guò)于饑餓或過(guò)度生長(zhǎng)
4． 操作時(shí),，避免污染母液，尤其是稀釋液（Reagent B）
5． 建議細(xì)胞染色完成后,，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
6． 孵育時(shí),，避免光照
7． 本公司提供系列膜流動(dòng)性檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰