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細胞多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性比色法定量檢測試劑盒
閱讀：1142 發(fā)布時間：2023-6-25技術背景
多聚ADP核糖聚合酶-1（Poly (ADP-ribose) Polymerase,；PARP,；EC 2.4.2.30）是一種鋅依賴性核酶,，廣泛存在于真核細胞中。PARP家屬由18個成員,，其中6個已經(jīng)被證實,，包括PARP-1（占90％）、PARP-2,、PARP-3、PARP-4（VPARP）,、PARP-5a/5b（tankyrase）等,。PARP蛋白由4個結構域構成：DNA結合,、切離、自修飾（automodification）,、催化等結構域。其功能在于特異性地識別DNA損傷產(chǎn)生的單鏈或雙鏈DNA斷裂,，并與之結合而激活,，催化將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,；NAD）轉(zhuǎn)化成煙酰胺（nicotinamide）和多聚ADP核糖分枝聚合體（branched polymers of various poly (ADP-ribose)）的反應，由此引導各種DNA修復蛋白聚集到損傷部位,，實施修復,，同時調(diào)節(jié)染色質(zhì)結構形成（chromatin structure formation）,、 細胞分化、繁殖,、發(fā)育,、凋亡、基因表達等，以及對于心腦缺血的反應和腫瘤惡變的作用,。抑制PARP活性,，可以防止心衰,、中風、敗血癥等引起的組織損害,。其中PARP-1由1014氨基酸殘基組成，分子量113Kd,，是細胞ATP/NAD細胞凋亡系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子,。基于人工合成底物ADP核糖對硝基苯酚（ADP-ribose-p-nitrophenol）,，在損傷的DNA存在的前提下，受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用,，釋放出顯色產(chǎn)物對硝基苯酚（p-nitrophenol）,，通過分光光度儀檢測吸光讀數(shù)的變化（405nm 波長）,，來定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。其反應系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應液（Reagent D） 微升
底物液（Reagent E） 微升
陰性液（Reagent F） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）,、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里,；底物液（Reagent E）避免光照,；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞
（微型）臺式離心機：用于樣品制備
比色皿或酶標板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前,，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作,。
一、 樣品準備（總蛋白制備）
1． 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 106細胞）
2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A）,，覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升裂解液（Reagent B）,，充分混勻
10． 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
11． 強力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二,、 測定準備
1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長405nm,，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化,；底物液（Reagent E）避免光照；緩沖液（Reagent C）室溫下預熱
三,、 背景對照測定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升反應液（Reagent D）
3． 加入xx微升底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升陰性液（Reagent F）
5． 上下傾倒數(shù)次,，混勻
6． 在25℃溫度下孵育2小時
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景讀數(shù)
四,、 樣品測定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升反應液（Reagent D）
3． 加入xx微升底物液（Reagent E）
4． 加入5微升待測樣品（（20微克核蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白））（注意：樣品須清澈）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在25℃溫度下孵育2小時
7． 即刻放進分光光度儀檢測,，此為樣品讀數(shù)
五,、計算樣品活性
六,、 酶標板測定
1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中
3． 分別加入xx微升反應液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）
5． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克核蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
6． 輕輕搖動酶標板
7． 在25℃溫度下孵育2小時
8． 即刻放進酶標儀檢測：獲得背景讀數(shù)和樣品讀數(shù)
9． 活性計算：
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20次操作,，包括背景對照
2． 操作時,，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清,，至關重要
5． 用戶可以選擇使用核蛋白替代產(chǎn)品中的總蛋白制備
6． 測定值由低到高變化,；反應可持續(xù)2小時
7． 比色測定后,，比色皿須清洗
8． 樣本測定2小時讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
9． 建議待測樣本蛋白濃度：核蛋白為20微克/5微升；總蛋白為100微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
10． 如果待測樣品濃度過高或過低,，可以調(diào)整樣品濃度
11． 多聚ADP核糖聚合酶-1單位活性定義為：在25℃,，pH 8.0條件下，每小時內(nèi)能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位
12． 本公司提供系列細胞酶學檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感