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植物氫ATP酶總活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒說明書
閱讀：1015 發(fā)布時間：2022-8-19主要用途
植物氫ATP酶（H＋-ATPase）總活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng),，在排除其它ATP酶干擾的情況下，受到氫ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過程中,，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng),， 即采用光譜法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法,。該技術(shù)經(jīng)過精心研制,、成功實(shí)驗證明的。其適合于各種植物組織,，包括種子（seed）,、葉片（leaf）、根（root）,、胚胎葉（cotyledon）,、上胚軸（epicotyl）等H＋-ATP酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌,，即到即用,，操作簡捷，性能穩(wěn)定,，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感,。
技術(shù)背景
氫ATP酶（H＋-ATPase,；EC3.6.3.6），又稱為質(zhì)子或氫離子轉(zhuǎn)位ATP酶（Proton-Translocating ATPases）,，在生物能量傳導(dǎo)過程中起著重要作用,。其分成三類：質(zhì)膜型（plasma membrane type或P型）、真細(xì)菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）,。質(zhì)膜型存在于植物,、酵母和胃酸分泌型囊泡的質(zhì)膜上，約100kd蛋白,；真細(xì)菌型存在于葉綠體,、線粒體和細(xì)菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成,；囊/液泡型存在于真核生物細(xì)胞器的囊泡系統(tǒng),。其中植物質(zhì)膜氫ATP酶，100kd分子量,，是植物細(xì)胞膜上重要的功能酶,，為植物生命活動的主要酶之一。液泡型氫ATP酶是V型ATP酶的主要成員,，400至600kd,，含有胞漿復(fù)合體（V1）和胞膜復(fù)合體（V0），通過產(chǎn)生電子泵,，轉(zhuǎn)移質(zhì)子,，是微粒體和溶酶體酸性化，同時提供次級活性轉(zhuǎn)運(yùn)體的動力,。氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機(jī)磷,。這一去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源,。同時利用細(xì)胞內(nèi)ATP釋放的能量逆向跨質(zhì)膜把質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞,，產(chǎn)生并保持細(xì)胞膜或細(xì)胞器兩側(cè)氫離子的電化學(xué)梯度，為一系列次級轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道蛋白對各種營養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量,。植物氫ATP酶還參與細(xì)胞內(nèi)pH水平,、細(xì)胞伸長、氣孔開閉、以及植物對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過程的調(diào)節(jié),。基于底物ATP,，在排除其它，包括鈣（EGTA處理）,、鈉鉀（烏本苷,；ouabain處理）和氫鉀（奧美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干擾下,，受到氫ATP酶的水解,，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中,，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,；NAD）,，其峰值的變化（340nm），來定量分析氫ATP酶的特異活性,。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
H＋-ATPase
ATP + H2O → ADP + Pi
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
（高吸收峰） （低吸收峰）
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 60毫升
裂解液（Reagent B） 20毫升
緩沖液（Reagent C） 20毫升
酶促液（Reagent D） 500微升
反應(yīng)液（Reagent E） 2.5毫升
底物液（Reagent F） 2.5毫升
陰性液（Reagent G） 1毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里,，避免反復(fù)凍融；底物液（Reagent F）,，避免光照,，有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
DOUNCE勻漿器：用于裂解組織
（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光譜分析的容器
分光光度儀：用于光譜分析
實(shí)驗步驟
實(shí)驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化,；底物液（Reagent F）注意避光,；緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作,。
一,、 樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒,、種子等）,，并秤重以確定組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入適量的（1克組織需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的1毫升裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器,，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管,，放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM,，例如eppendorf 5415）
10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣,，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM,，例如eppendorf 5415）
12． 即刻移入到1.5毫升離心管
13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
14． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二,、測定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如植物組織裂解樣品等）,，置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為28℃）：波長為340nm，間隔5分鐘,，讀數(shù)7次（共30分鐘）,，并置零
三、 背景對照測定
1． 移取730微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升酶促液（Reagent D）
3． 加入100微升反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入100微升底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入50微升陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數(shù)次,，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘
四、 樣品活性測定
1． 移取730微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升酶促液（Reagent D）
3． 加入100微升反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入100微升底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白,；樣品須溶解）
7． 上下傾倒數(shù)次,，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘
五,、 計算樣品活性
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量,；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量,；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或30（反應(yīng)時間,，分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
或者
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品重量,；毫克）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或 30（反應(yīng)時間,，分鐘）]＝單位/毫克
單位＝微摩爾NADH/分鐘
注意事項
1． 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照測定
2． 操作時,，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中,，背景測定只需1次
4． 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽,、鉀鹽,、鎂鹽、EDTA,、EGTA等,，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
5． 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定
6． 反應(yīng)測定值由高到低變化,；測定可以持續(xù)30分鐘
7． 測定值由高到低變化,，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
8． 光譜測定后,，比色皿須清洗*
9． 建議待測樣本總蛋白濃度為100微克/50微升,；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量,；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
10． 樣品特異活性是指排除其它,，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷,；ouabain處理）,、氫鉀（奧美拉唑,；omeprazole）等ATP酶的干擾后的氫ATP酶活性
11． 氫ATP酶活性單位濃度定義：在28℃溫度下，pH 7.5條件下,，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
12． 本公司提供系列ATP酶類分析技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確