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大鼠呼腸孤病毒III型ELISA檢測試劑盒
閱讀：1614 發(fā)布時間：2021-2-20本試劑盒用于體外定性檢測血清、血漿,、組織勻漿及相關液體樣本中大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3),。
有效期：6個月
保存條件：2-8℃
本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷
實驗原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標本、陰性和陽性對照,、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)呈正相關,。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，判定陰陽性。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測,。
4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或將上清置于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
需要而未提供的試劑和器材
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
4. 蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板 96孔 48孔 無
陰性對照 0.3mL 0.3mL 無
陽性對照 0.3mL 0.3mL 無
樣本稀釋液 6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液 6mL 3mL 無
封板膜 2張 2張 無
說明書 1份 1份 無
自封袋 1個 1個 無
注意事項
1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。
2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。
4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果,。
6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性,。
9. 不能使用過期產(chǎn)品。
10. 如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用,。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設置陰性對照孔、陽性對照孔和樣本孔,，陰性,、陽新對照孔各加50μL對照品；
3. 樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。
4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。
6. 每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。
7. 每孔加入終止液50μL,，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
實驗結果計算
1. 陰性對照OD值：小于0.2,。
2. 陽性對照OD值：大于0.8。
3. 陽性判斷（Cut-Off值）：陰性對照OD值+0.15,，樣本OD值大于閾值,，判定為陽性，反之,，為陰性,。