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BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)
閱讀：9542 發(fā)布時(shí)間：2020-11-5BCA 蛋白定量試劑盒
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
目前世界上的蛋白濃度檢測(cè)方法是：BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay
Kit)和 Bradford 蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit),。BCA 法與傳統(tǒng)方法相比更
簡(jiǎn)單、更穩(wěn)定,、更靈敏度。BCA 法測(cè)定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成
分的影響,，對(duì)于 5%以內(nèi)的 SDS、Triton X-100,、Tween 20,、Tween 80 具有很好的兼容
性,但 BCA 法測(cè)定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響,，在 BCA 法測(cè)定蛋白濃
度前應(yīng)盡量使：EDTA 濃度≤m10M,，DTT 濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。
在 50～1000μg/ml 濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系,，
其小檢出量為 25μg/ml,。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途,。
產(chǎn)品組成：
自備材料：
1,、酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)
2、96 孔板或 EP 管
3,、恒溫箱或水浴鍋
操作步驟(僅供參考)：
1,、取 1ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液*加入到含有 20mg 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)中，充分溶解后配制成
20mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,，配制后可立即使用,，配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)-20℃保存。
2,、取適量的 20mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,，稀釋至終濃度為 500μg/ml 或所需濃度。如取 25μ
l 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mg/ml),，加入 975μl 稀釋液,，充分混勻即配制成 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶
液。注意：待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中,，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中,，
一般可用 0.9%NaCl 或 PBS 作為溶解 BSA 稀釋液，稀釋后的 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液
也應(yīng)-20℃長(zhǎng)期保存,。
3,、根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑(A):試劑(B)=50:1 的比例配制 BCA 工作液,，即取 50 份 BCA 試
編號(hào)
名稱
250T
500T
2500T
Storage
試劑(A): BCA 試劑 A
50ml
100ml
500ml
RT 避光
試劑(B): BCA 試劑 B
1.5ml
3ml
15ml
RT
試劑(C): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)
20mg
20mg
20mg
RT
試劑(D): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液
5ml
10ml
10ml
RT
使用說(shuō)明書(shū)
1 份
BCA Protein Assay Kit
HLPT0001
HLPT0001
HLPT0001
上海哈靈生物科技有限公司劑 A 和 1 份 BCA 試劑 B,，充分混勻，即獲得 BCA 工作液(注意：正常 BCA 工作液應(yīng)為
蘋果綠或墨綠色,，如變?yōu)樽仙蚱渌伾珣?yīng)棄用),。例如取 5ml BCA 試劑 A 和 0.1ml BCA
試劑 B，配制成 5.1ml BCA 工作液,，BCA 工作液室溫 24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定,。
4、將 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按 0,、1,、2、4,、8,、12,、16、20μl 加到 96 孔板或 EP 管中,，
加稀釋液補(bǔ)足至 20μl,，其蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度依次為 0、25,、50,、100、200,、300,、400,、
500μg/ml,。
5、加 20μl 待測(cè)蛋白到 96 孔板或 EP 管中,，如果樣本不足 20μl,，用稀釋液補(bǔ)足至 20μl。
注意：如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測(cè)蛋白的溶液不同,，應(yīng)在待測(cè)蛋白中加入 20μl 稀釋
液,；如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測(cè)蛋白的溶液相同，無(wú)需在待測(cè)蛋白孔中加入 20μl 稀
釋液,，以減少不同溶液的差異,。
6、向各孔或 EP 管加入 200μl 配制好的 BCA 工作液,，37℃孵育 20～30min,。
7、酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測(cè)定 562nm 波長(zhǎng)處吸光度(如無(wú) 562nm,，540～595nm 之間的波
長(zhǎng)也可),，各孔或 EP 管吸光度減去未加 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以求得的差
值為縱坐標(biāo)：以標(biāo)準(zhǔn)孔或 EP 管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo),，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程,，
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白濃度。
注意事項(xiàng)：
1,、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)粉末溶解于蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液后,，即獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液(即 20mg/ml 的蛋
白標(biāo)準(zhǔn))，該原液中含有防腐劑,，不影響后續(xù)檢測(cè),，該蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液-20℃長(zhǎng)期保存。
2,、待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中,，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中,，否者待測(cè)
蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測(cè)定不準(zhǔn)確,。
3,、如果檢測(cè)效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min,，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不
斷加深,，顯色反應(yīng)也會(huì)隨溫度升高而加快；如果濃度較低,，可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間或在
較高溫度下孵育,。
4、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒(méi)有明顯變化,，可能的原因是
樣品中含有嚴(yán)重干擾 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的物質(zhì),。
5、BCA 法檢測(cè)時(shí),，待測(cè)樣本中不應(yīng)含有 EGTA,，否則影響檢測(cè)結(jié)果。
6,、因 BCA 法測(cè)定時(shí)顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深,，建議每次測(cè)定時(shí)都作標(biāo)準(zhǔn)曲線，且
顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān),，所以除非控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度,，否則每次都做
標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7,、如果沒(méi)酶標(biāo)儀,，也可用普通分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的小測(cè)定體積,，應(yīng)
按比例適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于小檢測(cè)體積,，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用
量亦相應(yīng)按比例放大；使用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度時(shí),，可以測(cè)定的樣品數(shù)量可能會(huì)顯
著減少,，建議把系列標(biāo)準(zhǔn)品用量增加至 100μl，BCA 工作液用量增加至 1ml,。
8,、為了加快 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過(guò)熱,，否則易失效,。
有效期： 12 個(gè)月有效。蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制成溶液后應(yīng)-20℃凍存,。附錄 1：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在室溫條件下按說(shuō)明書(shū)操作,，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行吸光度的
測(cè)定,，其數(shù)值及標(biāo)準(zhǔn)曲線如下(僅供參考)，我們建議采用 50,、100,、200、300,、400,、500
μg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)品濃度過(guò)高或過(guò)低都有可能影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性)：
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(μg/ml)
25
50
100
200
300
400
500
吸光度
0.010 0.035 0.094 0.141 0.237 0.319 0.405
注意：對(duì)于 10-50μg/ml 范圍內(nèi)的蛋白樣品，要充分考慮如 EDTA,、2-ME,、DTT 等干
擾因素，其檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)較大,，標(biāo)準(zhǔn)品亦有波動(dòng),，請(qǐng)注意小心精細(xì)操作
附錄 2：
與國(guó)內(nèi)產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，在室溫相同條件下按說(shuō)明書(shū)操作,，
對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行吸光度的測(cè)定,，采用 50,、100,、200、300,、400,、500μg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示 試劑盒斜率優(yōu)于某 BCA 試劑盒
及標(biāo)準(zhǔn)曲線如下(僅供參考)：
BCA