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犬超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫分析方法

閱讀：1382 發(fā)布時間：2019-10-15

犬超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 
試劑盒使用說明書 
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定犬血清,，血漿及相關(guān) 
液體樣本中超氧化物歧化酶（SOD）的活性,。 
實驗原理： 
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中犬超氧化物歧化酶（SOD）水平,。用純化的抗- SOD 
抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD）,， 
再與HRP 標(biāo)記的SOD 抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 
TMB 顯色,。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏 
色的深淺和樣品中的超氧化物歧化酶呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 
值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中犬超氧化物歧化酶（SOD）濃度。 
試劑盒組成： 
試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存 
說明書1 份1 份 
封板膜2 片（48） 2 片（96） 
密封袋1 個1 個 
酶標(biāo)包被板1×48 1×96 2-8℃保存 
標(biāo)準(zhǔn)品：180U/mL 0.5ml×1 瓶0.5ml×1 瓶2-8℃保存 
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1 瓶1.5ml×1 瓶2-8℃保存 
酶標(biāo)試劑3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存 
樣品稀釋液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存 
顯色劑A 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存 
顯色劑B 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存 
終止液3ml×1 瓶6ml×1 瓶2-8℃保存 
濃縮洗滌液（20ml×20 倍）×1 瓶（20ml×30 倍）×1 瓶2-8℃保存 
樣本處理及要求： 
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘,，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上 
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。 
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后,，離心 
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次 
離心,。 
3. 尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程 
中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實行,。 
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/ 
分）,。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞 
濃度達到100 萬/ml 左右,。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20 分 
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。 
2 
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?lt;br />
用。標(biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器 
將標(biāo)本勻漿充分。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。分裝后一份待 
檢測，其余冷凍備用,。 
6. 標(biāo)本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能馬上 
進行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融. 
7. 不能檢測含NaN3 的樣品,，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。 
操作步驟 
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，,、第二孔中分別加標(biāo) 
準(zhǔn)品100μl,，然后在、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻,；然后從孔、第二 
孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔,，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl， 
混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉,，再各取50μl 分別加到第五、第六孔 
中,，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻,；混勻后從第五,、第六孔中各 
取50μl 分別加到第七、第八孔中,，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混 
勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn) 
品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,， 
濃度分別為120U/mL，80U/mL ,，40U/mL,，20U/mL， 10U/mL）,。 
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測樣 
品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣 
品終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混 
勻。 
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘,。 
4. 配液：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用,。 
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去,，如此 
重復(fù)5 次，拍干,。 
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外。 
7. 溫育：操作同3,。 
8. 洗滌：操作同5,。 
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色 
15 分鐘. 
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。 
11. 測定：以空白空調(diào)零,，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止 
液后15 分鐘以內(nèi)進行。 
注意事項： 
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未 
用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。 
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間 
控制在5 分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。 
4．請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值 
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定,，計 
算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。 
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。 
6．底物請避光保存,。 
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7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn). 
8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。 
9．本試劑不同批號組分不得混用。 
10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準(zhǔn),。 
計算： 
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo),， 
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD 
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋 
倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo) 
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD 值 
代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋 
倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。 
（此圖僅供參考） 
試劑盒性能： 
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為0.92 以上,。 
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和15% 
檢測范圍： 
5U/mL -150U/mL 
保存條件及有效期： 
1.試劑盒保存：2-8℃,。 
2．有效期：6 個月

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