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酶聯(lián)免疫檢測(cè)中：ELISA試劑盒操作要點(diǎn)
閱讀：1479 發(fā)布時(shí)間：2018-2-26在進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實(shí)驗(yàn)中,，有很
多需要注意的地方,，由于ELISA方法廣泛應(yīng)用在各種抗原和抗體的此定中。但是測(cè)定中的影響
因素很多,，并且對(duì)操作有較高的要求,，所以，在實(shí)驗(yàn)中除了正常的相互反應(yīng),，還會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的
反應(yīng),，導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果,。
而造成這種錯(cuò)誤的可能因素有：標(biāo)本因素；試劑因素,；操作因素等,。
為此，本司針對(duì)常見問題做分析如下：
ELISA 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作要點(diǎn)
無論在什么研究中,，的試劑,、良好的和正確的操作是保證ELISA 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠
的必要條件。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的純化
水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm。
A 標(biāo)本的采取和保存
大部分ELISA 檢測(cè)均以血清為標(biāo)本,。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血，
紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,，溶血標(biāo)本可
能會(huì)增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè),。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性
HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng),。一般說來,，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中
保存時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG聚合,，使間接法的試劑本底加深,。超過一周測(cè)定的需－20℃保存。
凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡,?；鞚峄蛴谐恋淼?/p>
血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測(cè),。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落,，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)
本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存,。
保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作,，也可加入適當(dāng)防腐劑。
抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑
,。
B 加樣
加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,。
C 保溫
在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1
-2小時(shí),，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板
孔，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力
求準(zhǔn)確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成,，采用水浴會(huì)造成值偏高或花板,。另外溫育
中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會(huì)偏高,，建議為了客觀的判斷結(jié)果,，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
D 洗滌
洗滌在ELISA試劑盒過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗,。ELSIA就是
靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相
抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯
等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,。
可以說在ELISA操作中,，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視,，操作者應(yīng)嚴(yán)格
按要求洗滌,，不得馬虎。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離
子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán),，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合,，從
而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水
溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在
0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時(shí),，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。
洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用,。如果洗液需要稀釋,，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率
在1.5us/cm之下,，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制,。保證洗板浸泡時(shí)間為40秒左右，孔內(nèi)
液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好,，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡,。
E 顯色和比色
TMB經(jīng)HRP 作用后，約40分鐘顯色達(dá),，隨即逐漸減弱,，至2 小時(shí)后即可*消退至
無色。TMB的終止液有多種,，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止,。這
類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑,。此外,，各
類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值,。酶標(biāo)比色
儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀,，通常指于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)
讀速度,、讀數(shù)的準(zhǔn)確性,、重復(fù)性、度和可測(cè)范圍,、線性等等,。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可
到0.001，準(zhǔn)確性為±1%,，重復(fù)性達(dá)0.5%,。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)
室溫宜在15~30℃,，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘,，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定,。
測(cè)讀A 值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,，如OPD 用492nm波長(zhǎng),。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)
式測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次,，*次在適波長(zhǎng)（W1）,，第二次在不敏感波長(zhǎng)（W2），兩次
測(cè)定間不 移動(dòng)ELISA 板的位置,，終測(cè)得的A值為兩者之差（W1-W2）,。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少
由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾,。