水質  蛔蟲卵的測定  沉淀集卵法

蛔蟲卵測定適用范圍：

本標準規(guī)定了測定水中蛔蟲卵的沉淀集卵法,。 

本校準適用于地表水和廢水中的蛔蟲卵測定。

當取樣體積為10L時,，本方法的檢出限為5個/10L（注：不銹鋼開口直壁容器應選擇10L帶刻度）

規(guī)范性引用文件

本標準內容引用了下列文件或其中的條款,。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本適用于本標準,。

HJ/T 91地表水和污水檢測技術規(guī)范

方法原理：

沉淀集卵法主要通過樣品的濃縮,、雜質分離、鏡檢計數等環(huán)節(jié)對水中的蛔蟲卵進行測定,。用60目全不銹鋼篩網過濾去除樣品中交大的雜質,，利用蛔蟲卵比重大于水和易于沉淀的特性過夜沉淀濃縮水樣，用虹吸的放大棄去上清液,，用表面活性劑吐溫80作為殘液及沉淀轉移時的清洗劑,，進一步離心濃縮轉移的剩余物，收集到的濃縮物用乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻,，控制溶液PH值,，獲得親水-親脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪類雜質,，使蛔蟲卵更容易下沉,。再次離心濃縮樣品并棄去上部脂肪雜質層級緩沖液層，獲得的含卵沉淀層用飽和硝酸鈉溶液混勻,，于計數框中靜置漂浮后鏡檢,，即可測得水樣中蛔蟲卵的數量。

配套試劑和材料：

      分析時請使用符合國家標準的分析純化學試劑,，試驗用水為新制備的蒸餾水或者去離子水,。

一：乙酸乙酯（C4H8O2）       

二：乙酸-乙酸鈉緩沖液：PH=4.5

稱取15.0g三水合乙酸鈉(CH3COONa3H2O) ，溶于約800 ml實驗用水中,，加入3.6 ml乙酸(CH;COOH)調節(jié)pH值至4.5,， 用實驗用水定容至1000 ml。此溶液保質期為30d,。

三：吐溫80溶液: q (C24H4O6) =1 %o,。

      移取1ml吐溫80(Tween80)，用實驗用水稀釋定容至1000ml,臨用現(xiàn)配,。

四：飽和硝酸鈉(NaNO3) 溶液

      稱取略多于實驗環(huán)境溫度對應溶解度的硝酸鈉(NaNO3),充分溶解于100g實驗用水中,，用濾紙濾去殘渣，臨用現(xiàn)配,。硝酸鈉在不同溫度下的溶解度見附錄A,。

配套儀器和耗材：

      分析時如有量器請使用符合國家標準的A級量器

一：顯微鏡：物鏡4x,、10倍，目鏡10x倍

二：冰箱：0℃-4℃

三：水平轉子離心機：帶50ml螺口尖底離心管,，離心力1000g以上

四：漩渦混合器

五：篩網：60目 ,，孔徑250um 

六：不銹鋼開口直壁容器10L（帶刻度

七：開口直壁量筒：1000ml   A級

八：虹吸管

九：洗瓶

十：螺口尖底離心管50ml

十一：一次性巴氏滴管3ml、10ml

十二：微移液器：1000ul

十三：定量計數框：1ml網格,、5ml型

樣品：

按HJ/T 91中對一般污染物采樣的要求,，用10 L以上容積的塑料桶采樣。采樣前需用樣品蕩洗塑料桶,，采集樣品量應≥10L,常溫下運回實驗室,，立即進行過濾(7.1)和沉淀(7.2)。

分析步驟：

一：過濾

      充分搖勻樣品,，轉入不銹鋼開口直壁容器至10L刻度,。如樣品中含有草梗、紙渣等較大雜質,，需將樣品用篩網過濾,，并用吐溫80溶液清洗篩網及雜質，洗液并入過濾后的10L樣品中,。

二：沉淀

      上述樣品在15 C~25 C室溫下靜置過夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并棄去上清液,，避免擾動，保留1 L含沉淀物的樣品,，轉入1000 ml開口直壁量筒,，分別用50 ml吐溫80溶液*清洗不銹鋼開口直壁容器3次，洗液并入開口直壁量筒,。在15 C~25 C室溫下再次靜置過夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并棄去上清液,，避免擾動，保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的樣品,。

      注1:若樣品中蛔蟲卵濃度在10倍檢出限以上(>50個/10L),采樣時，可只采總量不小于1L的樣品,，取1L水樣直接進行第二步的量筒沉淀濃縮,。當樣品中含有草梗、紙渣等較大雜質,，同樣應先將樣品用篩網過濾,，并用吐溫80溶液清洗篩網及雜質，洗液并入1 L樣品中沉淀,。

離心：

沉淀濃縮后的樣品(7.2) 小心轉移至3個螺口尖底離心管,，分別用15 ml 吐溫80溶液*清洗開口直壁量筒3次，洗液均勻并入3個螺口尖底離心管,。以1000g 的離心力(離心機轉速計算見附錄A)離心15 min,用巴氏滴管小心吸取并棄去,，上清液,，少量留之，避免帶出沉淀,。

      用少量吐溫80溶液將3個離心管中的沉淀進行懸浮,，將沉淀量少的2個離心管中的懸浮液并入沉淀量多的一個離心管中:分別用3 ml~ 5 ml吐溫80溶液*清洗被轉移懸浮液的2個離心管，每支清洗3次,，確保沒有沉淀被丟棄,，洗液并入沉淀量多的離心管。以1000g的離心力離心15min, 用巴氏滴管小心吸取并棄去上清液,，少量留之,，避免帶出沉淀。

脂類雜質分離去除：

用與離心后沉淀等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液對沉淀進行懸浮(即:離心后沉淀體積為2 ml,加入2ml緩沖液,。如果離心后沉淀體積不足2ml,加入緩沖液至4 ml,。以確保用乙酸乙酯浸提后，沉淀上方有足夠體積的緩沖液,，便于脂類雜質層*傾出,，且避免蛔蟲卵沉淀層的丟失。

      加入2倍離心后沉淀體積的乙酸乙酯,，用渦旋混勻器*混合,。以.1000g的離心力離心15 min， 樣品被分為清晰的三層,。所有的非脂肪物質,、重碎片，包括蛔蟲卵,、幼蟲和原生動物在底層;中間層是緩沖液層;脂肪和其他脂溶性物質在上方形成黑而厚的一層,。

      將上層和中間層液體平穩(wěn)傾出棄去，記錄底層沉淀體積,。如有必要,，可用細針在離心管壁四周對上層的脂肪層進行松動。

鏡檢：

加入5倍底層沉淀(7.4)體積的飽和硝酸鈉溶液,，對分離去除脂類雜質后的含卵底層沉淀進行懸浮,。該懸浮液可置于0 C~4 C冰箱冷藏保存，備檢,，于1周內檢測完畢，檢測時需將其靜置至室溫,。充分搖勻懸浮液,，將其轉入定量計數框靜置5 min,在顯微鏡下計數,，直至全部懸浮液鏡檢完成,。分別用1 ml飽和硝酸鈉溶液充分洗滌鏡檢完的離心管3次,，將洗液轉入定量計數框，按以上步驟鏡檢,。所有檢測到的蛔蟲卵全部計數,。

      鏡檢時，需保持環(huán)境條件的穩(wěn)定,，無震動和風擾,，緩移計數框，自上而下“U”型逐列計數,?；紫x卵鑒定方法見附錄B。

空白對照試驗：

取10L同批次試驗用水,，按以上采樣及分析步驟進行全程序樣品的測定,。

結果計算于表示：

計算結果：

C------水樣中蛔蟲卵濃度（個/10L）

N-----檢測到的所有蛔蟲卵數（個）

Q-----實際水樣體積（10L）

結果表示：

      水質中蛔蟲卵的測定，實驗終結果取整數,，以“個/10L”為單位

精密度：

6家實驗室分別對實際樣品和低濃度(20 個/10L),、中濃度(40 個/10L)、高濃度(80個/10L)自配樣品的蛔蟲卵進行測定,，實驗室內相對標準偏差范圍分別為:6.5%~18.9%,，10.1%~22.0%，12.8%~23.8%,， 8.9%~ 17.4%;實驗室間相對標準偏差分別為5.8%,、5. 5%、4.9%,、4.8%; 重復性限(個/10L)為244,、3、7,、11;再現(xiàn)性限(個/10L)為260,、3、7,、11,。

質量保證和質量控制：

      每批次樣品至少做1個全程序空白實驗，并取10%的樣品進行平行樣測定,，全程序空白實驗不得檢出蛔蟲卵，平行樣間的相對偏差不得超過30%,。

廢物處理：

      實驗中虹吸液煮沸10min后可按普通廢棄物處理,，含乙酸乙酯的廢棄液應集中保管,，委托有資質的單位進行處理。

注意事項：

實驗用過的器具均需進行高溫滅活,，置于水中煮沸10min后方可再次使用,。

      實驗操作人員要注意自身防護，試驗時要穿戴工作服,、乳膠手套,、及口罩等,，同時還要避免蛔蟲卵的樣品污染實驗室環(huán)境,。

附錄A

硝酸鈉水中溶解度,、離心機離心力及轉速計算公式

A.1  硝酸鈉在水中的溶解度

表A.1   硝酸鈉水中溶解度

A.2離心力計算公式：

附錄B

蛔蟲卵的檢定

B.1蛔蟲卵的形態(tài)特征

B.1.1受精蛔蟲卵

      蟲卵呈短橢圓形，大小為45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm,。卵殼很厚，自外向內分為三層:受精膜,、殼質層和蛔甙層,，殼質層較厚，另兩層極薄,，在普通顯微鏡下難以分清,。卵殼內有一個大而圓未分裂的受精卵細胞，與卵殼間常見有新月形空隙,。卵殼外有一層由蟲體子宮分泌形成的蛋白質膜,，其表面凹凸不平呈波浪狀。隨糞便排出的蟲卵常被膽汁染成黃色或棕褐色,。

B.1.2未受精蛔蟲卵

      蟲卵呈長橢圓形或不規(guī)則形,，大小為88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm,，卵殼與蛋自質膜均較受精蛔蟲卵薄，淡黃色,，無蛔甙層，卵殼內含有許多大小不一的屈光顆粒,。

B.1.3感染期蛔蟲卵

      卵內含有一.條卷曲的幼蟲,。

B.1.4蛋白質膜脫落的蛔蟲卵

      若蛔蟲卵的蛋白質膜脫落,，卵殼則呈無色透明,，應注意與其他線蟲卵的鑒別,。

B.2蛔蟲卵參考圖片

B.2.1蛔蟲卵模式圖

B.2.2發(fā)育各階段的蛔蟲卵

附錄C

蛔蟲卵配置樣品的制備

豬蛔蟲(Ascaris suum)活成蟲采集自屠宰場，用蒸餾水洗滌干凈后,，放置于含4 %甲醛溶液內,，0 C~4 C保存?zhèn)溆茫砷L期保存,。

      制備蛔蟲卵備用液時,，選取2~3條雌性蛔蟲，用75 %乙醇消毒過的解剖刀,，劃開蟲體,，每條蛔蟲一- 對子宮選取靠近陰門的一段(2 mm~3 mm),解剖后,，將含蛔蟲卵的內容物及組織碎片放入50ml離心管中，加入數顆直徑1mm玻璃珠及10ml生理鹽水,，混勻后于渦旋混勻器振蕩3min~5min,用260目網過篩，取40ml生理鹽水分數次沖洗離心管和篩網,，此時獲得的濾液中蛔蟲卵呈單個狀態(tài)存在,。濾液加入甲醛至終濃度為4%，0 C~4 C保存?zhèn)溆?，可保?/span>1個月,。即制即用時可不添加甲醛。

      制備配制樣品時,，搖勻蛔蟲卵備用液,，用1000 μ1微量移液器，立即吸取適量的蛔蟲卵備用液于1ml定量計數框(網格)中,，計數后用250μl微量移液器向計數框中添加或移出蛔蟲卵至所需數量,。將計數框中所有的液體用吐溫80溶液沖洗入配制樣品中。再在顯微鏡下檢測計數框,，確保無蛔蟲卵殘留,。