Gibco 12662-029間充質(zhì)干細胞

性能參數(shù)
產(chǎn)品名稱： Gibco 12662-029間充質(zhì)干細胞
英文名稱： 12662-029 gibco  FBS
產(chǎn)品貨號： 12662-029
產(chǎn)品規(guī)格： 500ml
產(chǎn)品商標： gibco
保存與運輸：低溫

 

Gibco澳洲胎牛血清使用方法

         在細胞培養(yǎng)過程中，經(jīng)常加入5%-20%的胎牛血清,，zui常使用Gibco澳洲胎牛血清濃度是10%,。高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響后續(xù)實驗的結(jié)果,，我們在實驗中使用10%的Gibco澳洲胎牛血清培養(yǎng)293T細胞,，效果非常好。但是有些細胞也會使用5%的Gibco FBS或者20%的Gibco胎牛血清,，要根據(jù)具體 細胞選擇合適的Gibco胎牛血清濃度,。
 

Gibco澳洲胎牛血清保存方法

1、需要長期保存的Gibco澳洲胎牛血清必須儲存于-20℃ - 70℃ 低溫冰箱中,。4℃冰箱中保存時間切勿超過1個月,。切勿將血清在 37℃放置太久,否則血清會變得渾濁,同時血清中的有效成分會被破壞，而影響血清質(zhì)量,。如果一次無法用完一瓶,可 將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中,。由于血清結(jié)冰時體積會增加約10%,因此,血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一 定體積空間,否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂,。

2,、一般廠商提供的血清為無菌,無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾,切勿直接 過濾血清,。

3,、瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室溫,待全 部溶解后再分裝,一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度 與成分均一,減少沈淀的發(fā)生,。.切勿直接將血清從-20℃進入37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝集而 出現(xiàn)沉淀,。

4、熱滅活是指56℃, 30分鐘加熱已*解凍的血清.加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補體 成分滅活.除非必須,一般不建議作此熱處理,因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多,而且還會影響血清的質(zhì)量.補體 參與反應(yīng)有:細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞 發(fā)生化學趨化和活化,。

5,、血清中的沉淀物 絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會影響血清本身 的質(zhì)量.可用離心3000rpm,5分鐘去除,也可不用處理。 顯微鏡下"小黑點":經(jīng)過熱處理過的血清,沉淀物 的形成會顯著增多,。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象"小黑點",常誤認為血清受污染,。一般情況下,此小黑 點不會影響細胞生長,但如果懷疑血清質(zhì)量,則應(yīng)立即停止使用,更換另一批號的血清,。
 

Gibco胎牛血清使用中遇到的常見問題總結(jié)

一、血清滅活問題,。

1,、問：加到培養(yǎng)基中的血清必須滅活嗎？

答：不是必須的,，看做什么實驗了,。

2、問：Gibco胎牛血清滅活是56℃ 30分鐘嗎,？

答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細胞,，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長因子,。 但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補體受體的細胞,，如內(nèi)皮細胞，血清是需要滅活,，一般是56℃，30min,。

3,、問：我要做滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)，Gibco澳洲胎牛血清要滅活嗎,？

答：Gibco澳洲胎牛血清有專門的熱滅活型號,，貨號是10100147。

4,、問：我用病毒上清轉(zhuǎn)染細胞,，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因為血清中可能有些補體和抗體,，是不是會影 響轉(zhuǎn)染,？我想未滅活的血清中含些抗體補體可能會和病毒相結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染,，正確嗎,？細胞是單核細胞白血病細胞， 病毒是病毒包裝細胞PT67收集的病毒上清,。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時,，目的是什么？

答：血清一定要滅活,，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時以后再加血清,。避免雜蛋白對病毒和宿主 結(jié)合過程的干擾，一般是2-6小時,，根據(jù)細胞的狀態(tài)決定,。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補體滅活 ！這要根據(jù)實際情況而定,，如果沒有把握那就滅活吧,，也不麻煩56度半個小時。

5,、問：(1)我買的是Gibco北美胎牛血清,，要滅活嗎？有些說法是需要,，有些說直接解凍后就可以加入到培 養(yǎng)基中,；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS,，有關(guān)系嗎,？

答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭議的話題,。大多數(shù)實驗室將血清的熱滅活還是作為 常規(guī)來執(zhí)行,，因為有兩個作用，*是滅活補體,，第二是滅活血清中可能存在的支原體,。但是實驗者并沒有考慮熱處 理對血清中的生長因子、氨基酸等成分帶來的負面影響,。

我在實驗室處理血清的時候,，有一次水浴箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80℃,，血清變成了凝膠狀 ,，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對比,，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白,。在56℃下滅活半小時以 上，肯定也會對里面的蛋白起到破壞作用,。下次有機會我做個延長滅活時間的實驗試試,，看看到底有多大的影響。熱 滅活之后,，血清放在四度冰箱久了,，就會有沉淀產(chǎn)生，這常常會被認為是微生物污染或者是黑膠蟲污染,。為了驗證到 底有沒有污染,，常常又會把血清放置37℃溫育，但是血清中的蛋白會進一步析出,，zui后還是要做鏡檢,，無菌培養(yǎng)試驗 ,，和革蘭氏染色試驗，非常麻煩,。

我看過一份資料,，里面提到70%的實驗者認為滅活是理所當然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間,， 而時間則從15分鐘到60分鐘不等,。其中zui常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集,、處理,、加工工藝的提高 ，許多早先認為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立,，只有少數(shù)對血清進行熱滅活的研究者在實驗中證實了這一步驟的有效 性和必要性,。有人比較過11個不同細胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對6 個細胞株(HBAE,，MDBK,，Vero，成纖維細胞,，MRC-5) 的生長帶來負面影響,，三個細胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響,，而只有兩個細胞株(Balb/3T3,， Sp2/0Ag14 hybrid),，在熱滅活之后,，細胞生長有輕微的改善。所以,，在正常的操作下,，熱滅活通常對細胞的生長沒 有明顯的促進作用。

你可以摸索一下,，血清從-20℃冰箱拿出來之后在常溫解凍,，然后混勻分裝成兩份，一份滅活,，一份不滅活 ,，比較這兩種血清對細胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活,。這個過程zui多也就一個星期,。同時你還要考慮 血清滅活與否對你后續(xù)的實驗有沒有影響。

問：(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化,，卻見血清比較混濁,，有沉淀產(chǎn)生,，這屬正常嗎？

答：正常,。

Gibco 12662-029間充質(zhì)干細胞

二,、血清的保存問題。

1,、問：2016年6月到期的GIBCO胎牛血清到2017年5月還能用嗎,？

答：只有試試了，如果一直在-20℃凍著來者,，應(yīng)該還可以,，先少用點看看。養(yǎng)細胞系應(yīng)該沒問題,，原代不 行,。

2、問：請問我自然溶化好的胎牛血清和1640培養(yǎng)基今天用不上,，明天用,，我不想放到冰箱里，放在室溫下 一晚行嗎,？100毫升培養(yǎng)瓶加多少培養(yǎng)基呢,？

答：可以放4℃。4-5ml,。

3,、問：4℃冰箱內(nèi)保存3個月的胎牛血清，能否繼續(xù)使用,？相關(guān)細胞和其它試劑的代價比較高,，不敢輕易嘗 試。

答：需要長期保存的Gibco胎牛血清必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中,，4℃冰箱中保存時間不要超過1 個月,。

三、Gibco澳洲胎牛血清滅活時溫度問題,。

1,、問：因為實驗室水浴鍋失控，血清滅活時,，溫度到了61.7℃,，這血清還能用嗎？

答：多長時間??？短時間應(yīng)該可以吧，我有一次加熱了一個多小時,，還照樣用,。

2,、問：我滅活胎牛血清時，用的電磁爐,，定在了70℃,，本來說調(diào)溫度到56℃再放血清的，后來忘了,，就把 血清放進去了,，所以滅活的溫度肯定超過56℃了，不知道這樣對血清有沒有影響,？

答：常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間,，而時間則從15分鐘到60分鐘不等，其中zui常用的手法是56℃ 熱處理30分鐘,?？纯茨沭B(yǎng)的細胞是什么，一般的話估計問題不大,，要是很珍貴的細胞還是慎重一點啊,。熱滅活目的是 為了去除血清中補體等對熱敏感的物質(zhì)， 在對補體滅活以外,，熱處理同時也對血清中可能存在的支原體具有滅活作 用?，F(xiàn)在好像不主張熱滅活，熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來負面影響,，對血清的加熱經(jīng)常導致血清中沉淀的產(chǎn)生,，此外 ，有研究結(jié)果證實熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對細胞的促粘附作用,。

四,、FBS可否代替人AB型血清？

問：我現(xiàn)在在做人的外周血b淋巴細胞的培養(yǎng),，文獻上要求用人的AB型血清,，但是我覺得很多代理商都沒有 ,。我想FBS代替,，但不知道可否，我先是擔心免疫排斥之類,，但是我查了些資料后,，應(yīng)該不會(我覺得)。但是我又不 能夠TRY,。因為細胞因子確實太貴了,，所以咨詢一下。謝謝,！

答：你照文獻的做,。除非你系列實驗證明你用代用品的結(jié)果與文獻的相同(你還是要用到文獻的試劑) ,。細胞培養(yǎng)的影響因素很多，特別是培養(yǎng)基的成分,。

五,、血清的制備方法問題。

1,、問：我的實驗需要自己制備一些血清用于培養(yǎng)細胞,，有沒有人知道用于培養(yǎng)細胞的血清需要怎樣的制備 過程？

答：自己制備血清當心污染啊,。如果無菌條件好的話,，用靜置析出方法就行。

2,、問：一般我們用得胎牛血清用前還要滅活,，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活,？

答：你直接把采來的血液在離心管里4℃過夜,，離心，取上清,，在無菌過濾,，也可滅活，然后分裝凍存,，用 時再配,。

3、問：如果滅活會不會對血清中的一些因子有損傷,？

答：加熱可以滅活補體系統(tǒng),。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮,，細胞和血小板釋放組胺,， 激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究,、培養(yǎng)ES細胞,、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清,。滅活 一般不會對血清中的一些因子損傷的,。

六、心肌細胞原代培養(yǎng)時血清的使用問題,。

1,、問：在進行心肌細胞原代培養(yǎng)時，需要用含血清的培養(yǎng)基中止胰酶的消化作用，我現(xiàn)在使用的是含血清 10%的培養(yǎng)液,，但近日看北醫(yī)一個細胞培養(yǎng)的課件發(fā)現(xiàn),，有用1%血清培養(yǎng)液進行中止消化的,，想問一下,，1%的是否可 以，效果是否有保證,？這樣確實能節(jié)省不少血清的,。

答：關(guān)于心肌細胞元代培養(yǎng)的FBS問題：

(1)1%的血清*培養(yǎng)基可不可以,，得看你胰酶的用量。但是在心肌細胞元代培養(yǎng)就不行,。 10%的FBS* 培養(yǎng)基效果都不太好,，開始心肌細胞元代培養(yǎng)需要高濃度的FBS，20%左右,，但這就有出現(xiàn)另一個問題,，在FBS*培 養(yǎng)基中，成纖維細胞呈優(yōu)勢細胞,，須得在培養(yǎng)基加入適量的BrdU以抑制其生長,，純化心肌細胞。

(2)FBS的作用不僅僅是拿來中和胰酶,，只是FBS中的一些蛋白質(zhì)如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用 ,。

(3)元代心肌細胞培養(yǎng)的FBS使用，有講究：剛開始使用20%左右的高濃度的FBS,，后逐漸遞減為無血清的 DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng),。

2、問：我胰酶的用量是0.08% ,，并混和了0.08%的膠原酶,。FBS要高濃度遞減是否是說的在細胞培養(yǎng)中啊， 難道在消化時終止也需要如此高的濃度嗎,，還有,，我的BRDU只用到48小時就不用了，因為擔心其損傷太大,，可以持續(xù) 用多久呢,？

答：我用10%FBS終止的，然后差速1h,，然后還是用10%FBS的HG-dmem養(yǎng)的,，沒有用brdu,，心肌細胞還是比 較多和穩(wěn)定的,，我第3天就可以用，第2天晚上看就會有搏動,。

七,、血清和培養(yǎng)基的種類及品牌問題,。

1、問：細胞培養(yǎng)的胎牛血清用哪個公司的產(chǎn)品比較好呢,？周圍有人用PAA或Hyclone的,，這兩種跟Gibco或 sigma出品的差別大嗎？

答：如果是長得非?？斓眉毎鏿a317,，293，c6等惡性腫瘤細胞,，一般得國產(chǎn)血清就可以,，如果是原代培 養(yǎng)的細胞，應(yīng)用胎牛血清或類標準胎牛血清,，Hyclone公司血清的質(zhì)量不如GIBCO(同類血清),。國產(chǎn)的杭州四季 青和甘肅民海（中美和資）不錯。有些細胞(如：sf9,，293還有其他一些元代細胞),，用Gibco的比其他兩種好很多， 會大大加速試驗進度,。對于其他一些細胞(如：vero,，MDCK，pk)四季青,，Hyclone的小牛血清足矣,！另外，Gibco的 還要看產(chǎn)地,。

2,、問：zui近要訂一瓶胎牛血清，實驗室之前都在用小牛血清,，沒有買過胎牛血清,。請問哪個公司的好一些 ？問過試劑公司,，有兩種：一種是PAA的(分普通級和優(yōu)級),，一種是Hyclone的(只有普通級，而且是新西蘭產(chǎn)的),。 試劑公司推薦使用PAA優(yōu)級的,，但看好多文獻都用Hyclone的，公司說是因為現(xiàn)在Hyclone的都不是美國進口的了,。請 問用的哪種胎牛血清比較好,？

答：民海的效果還不錯，要是不放心國產(chǎn)的，那就買進口的,。進口的好多公司都有,，新西蘭產(chǎn)的效果一般 。Hyclone和Gibco澳洲胎牛血清的都還可以,。民海的似乎比四季青的要好些,。復(fù)蒙的感覺也不錯。

3,、問：四季青“無噬菌體,、低內(nèi)毒素胎牛血清”與“無支原體胎牛血清”的區(qū)別 ？培養(yǎng)腫瘤傳代細胞用哪一個比較好些,？

答：用無支原體胎牛血清就可以啦,。

4、問：SKBR-3細胞培養(yǎng)用哪種型號的1640培養(yǎng)基及胎牛血清,？

答：我一直用GIBCO的1640,，你可以買含HEPES的1*10L的包裝，胎牛血清也是用的GIBCO,，10%就行,。

八、牛血清污染噬菌體的問題,。

1,、問：有誰知道小牛血清過程中怎樣能夠避免噬菌體的污染，以及對已污染噬菌體的牛血清怎樣能夠 除去噬菌體,？

2,、問：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌體,，它對細胞培養(yǎng)到底有什么影響,？

暫無回答。

九,、培養(yǎng)基血清濃度問題,。

問：在1640里加血清時加多了，90ml里加了20ml血清,，約為18%,，以前都是加10ml的，查了網(wǎng)上多建議用 10%-15%,，有關(guān)系嗎,？

答：我認為一般來說血清濃度的較大波動對細胞的狀態(tài)影響較大，建議再加90ml1640調(diào)成10%,。血清濃度大 當然細胞狀態(tài)感覺要好,，但是高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜,，影響后續(xù)實驗的結(jié)果。10%的濃度培養(yǎng)鼻煙 癌細胞很好,。

十,、問：MTT加藥的時候加不加血清,？加藥時要用無血清的培養(yǎng)基嗎,？

答：我的藥就是用含血清的培養(yǎng)基稀釋的，不含血清的培養(yǎng)基對細胞有毒性或抑制作用,，無形中對細胞造 了一個serum-free的模型,，細胞在提內(nèi)本來就是有血清供應(yīng)，如果該藥物都不能對抗,，那該藥物就沒有什么臨床價 值了,，這是我的理解。

十一,、PC12細胞培養(yǎng)所用血清問題,。

問：我正準備購買上海細胞所的未分化的PC12細胞，需要滅活的馬血清,，可現(xiàn)在買血清很困難,，好像是海 關(guān)有，代理商這么說的,，我原定購買的Gibco的horse surum,，現(xiàn)在無法買到了，好容易找到一個目前可以進血 清的公司Hyclone,，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎,？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個,。我當時是在鼎國(重慶辦事處)買的,， 100ml大概140元，具體不記得了,。當時是看它比別的進口的馬血清便宜,。另外：我買了以后滅活的。

十二,、AB血清的制備問題,。

問：本人想從人的外周血中分離AB血清的，用于B淋巴細胞的培養(yǎng),。謝謝大家給點建議,。人的血，來之不易 啊,。

答：是AB血型人的血清嗎,？這種血清即沒有抗A型抗原抗體,，也沒有抗B型抗原抗體。分離血清時將采集的 血液注入試管中,，待血液凝固后離心分離血清,。可將采集的血液放在37℃水浴箱中促進血液凝固,，減少凝固時間,。離 心可在2500～3000rpm，10min,，足可以分離血清,。分離后將血清吸出保存即可。分離血清的量可按采集血液的50%左 右計算,，因為紅細胞占總血液的50%左右,。當然整個過程要注意無菌操作。

十三,、Gibico澳洲胎牛血清內(nèi)是否含糖,？

問：我想做糖誘導細胞凋亡的試驗。細胞培養(yǎng)液里加入了20%的胎牛血清,。因此胎牛血清里是否含有糖對我 實驗的培養(yǎng)液糖終濃度影響比較大,。今天打問GIBCO公司的技術(shù)顧問，回答我糖濃度少于5μg/ml,，因此基本 可認為是不含糖,。但我今天把胎牛血清送到我們醫(yī)院檢液科，結(jié)果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法),。難道是檢 測人血清的血糖濃度的方法不能用于檢查牛血清嗎,？(另起茶水驗?zāi)蚴录?檢驗科沒有給我回答。

答：應(yīng)該是不含糖的,。請參照gibco的： 第五頁我做了個記號,。直接 點擊鏈接就可以看到它的說明書頁面。我想我們肯定要以公司的說明書為準,。至于為什么檢驗科測起來有誤差,，我想 可能是樣本不一樣，需要用標志品矯正有關(guān),。具體需要檢驗科的戰(zhàn)友解釋了,。

十四、血清或培養(yǎng)基產(chǎn)生了顏色或沉淀的問題：

1,、問：我用的是四季青的胎牛血清,，56℃30分鐘滅活后出現(xiàn)了白色少量絮狀沉淀，是不是污染,？還能不能再用,？,。

答：應(yīng)該問題不大。你可以取少量血清放入培養(yǎng)皿中,，37℃過夜培養(yǎng)看看就知道是否污染了,。血清中沉淀 物的出現(xiàn)有許多種原因，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在 血渭解凍后,，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一,。但這些絮狀沉淀物,，并不影響血清本身的質(zhì)量,。 若您欲去除這些絮狀沉淀物,，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起 過濾,。

2、問：我用MTT法測細胞的增殖,，用DMSO裂解細胞,，發(fā)現(xiàn)把DMSO加入到孔中就會形成乳白色(用的含胎牛血 清的1640培養(yǎng)基，由于沒有離板子的離心機,，所以沒有去除培養(yǎng)基直接加的DMSO),。以前用含小牛血清的培養(yǎng)基沒有 看到有這種情況。該怎么解決,？

答：為什么要用離心機離心呢,？難倒你養(yǎng)的是懸浮細胞嗎？如果是貼壁細胞的話直接將MTT倒掉,，再加DMSO 即可,，我們就是這么做的，效果很好,！并且測細胞的增殖的話如果不去掉MTT就加DMSO的話誤差應(yīng)該很大,！有時不一 定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的時間或以及其他成分有關(guān),！

3,、問：(1)GIBCO澳洲胎牛血清500ml，今天解凍后沒有混勻直接分裝,，結(jié)果使得前面的幾管是清亮的,，后面就 帶有棕色的，不知有沒有影響,？估計有什么影響,？前面的成分好還是棕色的成分好?。?/p>

答：肯定有,。還是重新混合重新分裝,，我覺得有效成分會集中在棕顏色部分。

問：(2)為什么會出現(xiàn)棕色呢,？

答：血清中的棕色多一些可能是因為紅蛋白的含量高些的緣故吧,。

問：(3)血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天滅活的,，但是沒有加到培養(yǎng)基里,，而是放在冰箱里，那下次 可以直接用嗎,？還是再次滅活?。?/p>

答：當然可以,，如果多的話,，分裝后放在－20℃，下次用時再解凍,，也不用再滅活,。用一管拿一 管，少許血清可以放在4℃,。分裝時還要注意不要裝得太滿,，以免溢出污染。

十五,、污染和過濾的問題,。

1、問：懷疑血清染菌,，想用濾膜過濾一下,，可否自己用0.22μm濾膜過濾？對血清性質(zhì)有多大影響,？有 做過的么,？

答：可以過濾的，Gibco澳洲胎牛血清當出廠時都是0.22μm或0.1μm過濾除菌,。想證明有沒有染菌不用過濾這么麻煩 ,，只要放置于37℃過夜就可以了，如果有微生物污染會變渾濁的,，如果還是澄清的就說明沒有問題的,。實驗室中血清 很難直接過濾，一般要加到培養(yǎng)基中再過濾,。我們實驗室制備培養(yǎng)基時,，都使用濾膜過濾,，一般而言如果制備1-2瓶 培養(yǎng)基，一個濾膜及一支30ml注射器可以過濾50ml小牛血清,。如果大量制備培養(yǎng)基也可以將血清加到培養(yǎng)基中,，使 用0.22微米的大濾膜一起過濾。

2,、問：我懷疑我用的*1640培養(yǎng)液被污染了,，準備重新過濾消毒，過濾后是否需要補充胎牛血清,？如需 又如何補充,？

答：*1640培養(yǎng)液被污染了，如果是支原體的話,，過濾沒有作用,，支原體可以通過濾膜。我們用1640液 ,，都是配液后保留500ml,，然后其他的分裝100-200ml,，現(xiàn)用現(xiàn)配因為血清比1640要貴,，如果你想過濾的話，建議你 加原比例血清,，因為血清不會很容易通過濾膜,。zui主要的還是找到可能污染的原因。

3,、問：加好了血清雙抗的培養(yǎng)基由于污染了再過濾后還能用嗎,？

答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經(jīng)污染,，那么細菌污染的可能性會較小了,。一般的過濾除不能 去除病毒或者部分真菌的污染的。

4,、問：我準備把使用的*1640培養(yǎng)液重新過濾一遍,，不知道培養(yǎng)液中的血清成分是否能通過濾膜，過濾 后是否還需要補充胎牛血清,？如需又如何補充,？

答：可以透過，但是隨著液體量的增多會很慢,，如果不加壓會比較麻煩,，還有用低蛋白吸附的，不然 損失是比較大的,。

十六,、問：懸浮細胞培養(yǎng)時能否加血清,？如果加了會有什么結(jié)果？為什么懸浮細胞培養(yǎng)時就不能加血清,？

答：血清是細胞培養(yǎng)基中重要的培養(yǎng)成份之一,，對細胞生長有廣泛影響。在細胞培養(yǎng)時,，我們通常會加入 10%的血清,。血清的質(zhì)量對細胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。一般說來,，牛血清包括以下成分：生長因子(如激素,，白細胞介 素等)，他們可以促進細胞生長,；貼附因子,，他們可以促進細胞的貼壁，往往只有細胞貼壁才能增值(懸浮培養(yǎng)的細胞 除外),；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白,，球蛋白等)，既可以作為營養(yǎng)物質(zhì),，又可以中止胰酶的作用,；還有很多成分不明的物 質(zhì)。血清還可以起到解毒作用,，如脂肪酸,、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細胞免受機械損傷,。因此,，無 論是貼壁細胞還是懸浮細胞，血清是*的,。除非因?qū)嶒炓鬅o血清培養(yǎng)時,，例如：為使細胞同步化時，我們會 采用無血清培養(yǎng)的,。單純的說懸浮細胞培養(yǎng)不能加血清就沒有太多的道理了,。

十七、關(guān)于中和消化液需要的血清量,。

問：用胰蛋白酶消化細胞后,，需要用血清中和。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是 多少,？

答：做了很久的試驗,，真的沒有想過胰酶和血清的對應(yīng)關(guān)系。不過細想下來，這個應(yīng)該也沒有固定的比值 ,。血清的品種都是不同的,，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比值關(guān)系,？我們消化細胞的時候,，如果是傳代， 細胞變形后,，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培,，這個量看自己的喜好和吹打細胞方便而定。一般都可以中 止消化的,。不會存在繼續(xù)消化的事情,。如果是從組織上消化細胞做原代培養(yǎng)，我一般都使用全培進行中止,，而且加的 很多,，0.25%的胰酶，用10%血清,，按1:2的比例應(yīng)該是足夠的,。當然全培是2，一般我養(yǎng)細胞的時候,，會用國產(chǎn)的比 較便宜的血清配制全培,，專門用于中止消化，這樣有幾個好處：一是中止消化的效果應(yīng)該好于hanks液吧,，再是也有 利于維持細胞活性,。而且這部分液體會被離心去掉，血清便宜,，離心掉了不會心疼。而養(yǎng)細胞的時候用好血清,。個人 觀點,，僅供參考。

十八,、Gibco澳洲胎牛血清中的懸浮物問題,。

1、問：發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細胞瓶中背景有許多的小黑點,，培養(yǎng)液中也有一些漂浮的物,。看了之前的帖以為是膠原 蟲,。本打算換液,，換液前特意看了下前些天配的培養(yǎng)液，肉眼發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有懸浮的顆粒狀物質(zhì)(不多)，于是放在鏡 下觀察,，新鮮培養(yǎng)液中有一些懸浮的小顆粒,，不多。(培養(yǎng)液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)于是又將分裝在4℃保存的 小牛血清拿出觀察,，肉眼可見5,、6個白色小小球狀的物質(zhì)，在血清瓶稍靠下的部位懸浮,。鏡下觀察,，也有少量的不知 什么物質(zhì)的東西漂浮。小牛血清是Hyclone新西蘭的,，標簽上寫已經(jīng)經(jīng)過2μm濾膜過濾處理,。根據(jù)上述培養(yǎng)液的情 況，是否說明培養(yǎng)液已被污染,？如果是正常的血清是不是在鏡下不應(yīng)該看到雜物,，哪怕是極少量的？根據(jù)上述血清的 描述,，是不是說明血清也存在問題,，還能用嗎？補充：細胞培養(yǎng)以來生長狀態(tài)就不好,。買血清的時候廠家說明不用滅 活,，所以未滅活。

答：(1)Gibco澳洲胎牛血清應(yīng)該-20℃保存,，解凍血清時,，請按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變 的溫度太大實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物,。

(2)血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因,，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 在血清解凍后,，也會存在于血清中,，亦可造成沉淀物。

(3)若您一次無法用完一瓶,，建議您無菌分裝血清,，再放回冷凍，若存放于4℃時,，請勿超過一個月,，儲存 在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白,，可能聚集而形成沉淀或可見的混濁,。

(4)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一,，減少沉淀的發(fā)生,。

(5)排出了血清的原因，在考慮實驗用品和無菌操作的問題,。

(6)細菌病毒,、衣原體、黑膠蟲污染也很常見,，如果細胞死的太多,，影響較大建議更換培養(yǎng)液。

2,、問：今天在配培養(yǎng)液時,，發(fā)現(xiàn)血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮,，不渾濁,。不知道是什么， 問了實驗室的學長,，說仍然可以用,，但還是不放心，沒有用血清,。求助園子的各位達人,，這可能是血清出了什么問題 ？我的血清用了一個月不到,，四季青的,。

答：可能的原因：(1)培養(yǎng)液配置時Votex不夠，當時是清亮的,，但過一段時間會析出來,；(2)真菌污染。

十九,、更換無血清培養(yǎng)基后細胞大量死亡的問題,。

問：我使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染成骨細胞，在轉(zhuǎn)染前要換上無血清的培養(yǎng)基,。本來條件模的好好的，轉(zhuǎn) 染效率也可以接受,。但是寒假一回來就發(fā)生了怪事：細胞在有血清的培養(yǎng)基中長的好好的,，一換無血清的培養(yǎng)基就死 亡。大概4個小時就能看到較多的細胞飄起來,。但是原來我換無血清培養(yǎng)基,，就算放那里10個小時都是沒問題的啊。 已經(jīng)換了不同批次的培養(yǎng)基，甚至吸管什么的都換過了,，但是就是不行,，是怎么回事？

答：(1)兩周后的培養(yǎng)液應(yīng)補加谷氨酰胺,，或者重新配液,，轉(zhuǎn)染時應(yīng)不含抗生素。

(2)確認操作方法和環(huán)境,，建議檢查一下,。

(3)Lipofectamine2000，脂質(zhì)體的毒性很大,，如果有質(zhì)粒參與對細胞損傷更大,，如果Lipofectamine2000 在常溫放置過，對細胞更大,，假期冰箱是否斷過電,。

(4)培養(yǎng)箱的溫度、c02濃度,，濕度,。

二十、*培養(yǎng)液的相關(guān)定義,。

問：“*培養(yǎng)液一詞”,，是指加了血清的培養(yǎng)液嗎？我在做含藥血清的實驗,，涉及到血清添 加量的問題,。所以想弄明白文中所指的“*培養(yǎng)液”是否是含藥血清。

答：原液是指配置后過濾除菌,。不*培養(yǎng)液是指不含有血清的原液,，其他成分已補充。*培養(yǎng)液是指 不*培養(yǎng)液加入血清后稱*培養(yǎng)液,。

二十一,、血清相關(guān)知識總結(jié)。

使用Gibco澳洲胎牛血清的注意事項：

血清是細胞培養(yǎng)中zui重要的元素之一,。下面是實驗室里常會遇到的問題,，僅供大家參考：

1、保存血清的方法：

建議血清應(yīng)保存在-5℃ 至 -2O ℃ ,。然而,，若存放于 4 ℃ 時，請勿超過一個月,。若您一次無法用完一瓶 ,，建議您無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀?nèi),，再放回冷凍。

2,、如何解凍Gibco澳洲胎牛血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損：

建議您將血清從冷凍箱取出后,，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶,。但必須注意的是,， 溶解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

3,、Gibco澳洲胎牛血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn),，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但zui普的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白(形成 凝血的蛋白之一)在血渭解凍后,，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一,。但這些絮狀沉淀物,，并不影 響血清本身的質(zhì)量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物,，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi),，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培 養(yǎng)基內(nèi)一起過濾,。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

4,、何謂熱滅活：

一般是以 56℃ ,， 30 分鐘來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟,，可以使補體去活化,，而補體所參與的 反應(yīng)有 : 溶細胞活性，平滑肌的收縮,，肥大細胞和血小板組胺的釋放,，增強吞噬作用，淋巴細胞,、巨噬細胞的趨化 和激活,。

5、關(guān)于Gibco澳洲胎牛血清的滅活：

有必要做熱滅活嗎,？

實驗顯示,，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的,。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生 長只有微小的促進,，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量,，而造成細胞生長速率的降低,。 而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多,，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察,，像是“小黑點” ，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中,，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是 微生物的擴增,。

因此我們建議您,，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步,。如此一來,，不但節(jié)省您寶貴的時間，更確保 您血清的質(zhì)量,！

6,、血清相關(guān)知識：

如何避免沉淀物的產(chǎn)生？

我們建議您在使用血清的時候,，注意下列的操作 :

(1)解凍血清時,，請按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃ 至37℃),，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物,。

(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一,，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久,，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會 因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量,。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要,，可以無須做此步驟,。