一．“兔子抗中性粒細(xì)胞顆?？贵w(ANGA)ELISA試劑盒”實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗C3抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗C3抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的C3呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度,。

二．實(shí)驗(yàn)材料與試劑配制

1.儀器與材料：酶標(biāo)儀（使用前預(yù)熱30分鐘）,，微量加液器、吸頭,、蒸餾水或去離子水,，濾紙,。

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液備用。

三．樣品收集,、處理及保存

1）.細(xì)胞培養(yǎng)上清：

適用于檢測體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌性成份,。用無菌管收集細(xì)胞上清液，以1000×g離心15分鐘,，收集上清,。

2）細(xì)胞：

用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到104-106/ml 左右,，通過反復(fù)凍融,，使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份，或者細(xì)胞超聲粉碎,，離心取上清液檢測,。

3）血清：

在室溫下，血液自然凝固,，以1000×g離心15分鐘,，取上清待測。

4）血漿：

應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合后靜置10-20 分鐘后,，以1000×g離心15分鐘，收集上清,。

5）體液：

包括胸腹水,、腦脊液，分泌物等,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集,，以1000×g離心15分鐘，收集上清,。

6.）組織標(biāo)本：

切取組織標(biāo)本,，稱取重量0.5mg，加入500ul 的PBS,，用手工或勻漿器,，或超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿，以2000-3000 rmp離心20 分鐘,，收集上清進(jìn)行檢測,。

樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

7）保存：

如果樣品不能立即檢測,，應(yīng)將其分裝，-70 ℃保存,，避免反復(fù)冷凍,。保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。血液標(biāo)本盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中含大量顆粒,，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

四．“兔子抗中性粒細(xì)胞顆粒抗體(ANGA)ELISA試劑盒”操作步驟

1）取出試劑盒,，室溫（20-25℃）放置30分鐘,。

2）分組：取出96孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理,。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組（6個(gè)濃度）、空白孔,、待測樣品組,。

3）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備小試管6 只，依次編好號碼,，先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100ul,，然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中,，充分混勻,；再在該試管中取100ul加入第三只試管中，充分混勻,；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中,，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第五只試管中,，充分混勻；然后在該試管中取100ul,，棄掉,。第六只試管作為0 號標(biāo)準(zhǔn)品。

注：為減少實(shí)驗(yàn)誤差,，保證準(zhǔn)確性,，建議設(shè)置復(fù)孔。

4）加樣：依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中,；空白對照孔加入50ul的蒸餾水,；其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標(biāo)記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

5）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

6）洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30 秒棄去,，如此重復(fù)5 次，拍干,。

7）加酶標(biāo)溶液：標(biāo)準(zhǔn)品組,、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標(biāo)溶液（空白對照孔除外）。

8）溫育：酶標(biāo)板用封板紙密封后,，放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時(shí),。

9）洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15-30s,，充分清洗酶標(biāo)板5次,，用吸水紙*拍干。

10）顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后,，再加入顯色劑B液50ul,。

11）終止：25-37℃下避光反應(yīng)10-15分鐘，加入50ul終止液,。

12）讀板：在450nm波長讀取各孔的OD值,。

注：讀板時(shí)必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時(shí)間控制在終止反應(yīng)后的30分鐘內(nèi),，以免影響準(zhǔn)確性,。

五．洗板方法
1.  手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
2.  自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人C3，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

六．注意事項(xiàng)

1）實(shí)驗(yàn)操作中必須使用一次性吸頭,，避免交叉污染。

2）加樣：加樣時(shí)，要控制加樣速度,，避免*孔與zui后一孔間的時(shí)間間隔過大,，否則將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時(shí)間，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性,。

3）孵育：嚴(yán)格按照說明書上規(guī)定的孵育時(shí)間和溫度進(jìn)行,。

反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如果顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),。

4）建議實(shí)驗(yàn)前預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高,，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,，計(jì)算結(jié)果時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

5）建議使用本試劑盒時(shí)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)（即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，試用幾個(gè)標(biāo)本）,，如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經(jīng)銷商,，如果因運(yùn)輸過程導(dǎo)致試劑盒失效,，可要求調(diào)換，但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失,。

七．ELISA試劑盒的性能：
準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900。
靈敏度：zui低檢測濃度小于10 pg/ml,。
特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。
重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%,。

八.ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作的常見問題：

1. 問--客戶用48T試劑盒,，大概只有十個(gè)樣所以他一次用不完那么多板條，但是他想做兩次,，可封板膜只有一張,，那如果用完了怎么辦？可以用什么別的東西取代嗎,？

答--可以把封板膜剪掉,，用多少剪多少也可以用封口膜替代。
2. 問--實(shí)驗(yàn)過程中溫育是放在哪溫育呢,？
答--可以在水浴箱、細(xì)胞培養(yǎng)箱和烘干箱里面都行,，只要恒定溫度為37度,。

九．“兔子抗中性粒細(xì)胞顆粒抗體(ANGA)ELISA試劑盒"訂貨說明

1）賣方確保所訂產(chǎn)品與目錄技術(shù)指標(biāo)保持*,；

2）為了確保買方產(chǎn)品在運(yùn)輸中的質(zhì)量,，對有特殊要求的低溫產(chǎn)品予以濕冰運(yùn)輸,。

3）收到貨物后如出現(xiàn)質(zhì)量問題，買方需在收到貨物一個(gè)月內(nèi)向賣方提出書面異議,。買方逾期不提出異議,，視為貨物符合其要求，賣方不付任何責(zé)任,。

4）出現(xiàn)質(zhì)量以外的問題,，如破損等，買方應(yīng)在收貨后一個(gè)周內(nèi)提出,。買方未按時(shí)提出異議,，視為該產(chǎn)品合格。

本公司對所有售出的產(chǎn)品保證質(zhì)量,，并提供良好的售后服務(wù),，有關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的投訴，請?jiān)谑盏截浳锏?2天內(nèi)以書面形式提出,，并向我公司技術(shù)人員提供相應(yīng)的材料,，我們會及時(shí)派人解決。所有形式的賠償或退換僅限于產(chǎn)品本身,，不涉及其他間接內(nèi)容,。凡購買本公司任意款elisa試劑盒，均可享受免費(fèi)代測服務(wù),，并提供技術(shù)指導(dǎo),。