一．“兔子內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒”實驗原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,，又保留酶的活性。在測定時,，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應,。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體,，也通過反應而結(jié)合在固相載體上,。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析,。

二．實驗材料與試劑配制

1.儀器與材料：酶標儀（使用前預熱30分鐘）,，微量加液器、吸頭,、蒸餾水或去離子水,，濾紙。

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液備用,。

三．樣品收集,、處理及保存

1）.細胞培養(yǎng)上清：

適用于檢測體外培養(yǎng)的細胞分泌性成份。用無菌管收集細胞上清液,，以1000×g離心15分鐘,，收集上清。

2）細胞：

用PBS反復洗滌細胞3次,，調(diào)整細胞濃度達到104-106/ml 左右,，通過反復凍融，使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,，或者細胞超聲粉碎,，離心取上清液檢測。

3）血清：

在室溫下,，血液自然凝固,，以1000×g離心15分鐘，取上清待測,。

4）血漿：

應根據(jù)標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘,，收集上清,。

5）體液：

包括胸腹水,、腦脊液，分泌物等,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集,，以1000×g離心15分鐘，收集上清,。

6.）組織標本：

切取組織標本,，稱取重量0.5mg，加入500ul 的PBS,，用手工或勻漿器,，或超聲破碎儀將標本勻漿，以2000-3000 rmp離心20 分鐘,，收集上清進行檢測,。

樣品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

7）保存：

如果樣品不能立即檢測,，應將其分裝，-70 ℃保存,，避免反復冷凍,。保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心,。血液標本盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

四．“兔子內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒”操作步驟

1）取出試劑盒,，室溫（20-25℃）放置30分鐘,。

2）分組：取出96孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理,。分別設(shè)標準品組（6個濃度）、空白孔,、待測樣品組,。

3）標準品的稀釋：準備小試管6 只，依次編好號碼,，先在各小試管中加入標準品稀釋液100ul,，然后取原濃度標準品100ul加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中,，充分混勻,；再在該試管中取100ul加入第三只試管中,，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中,，充分混勻,；再在該試管中取100ul加入第五只試管中，充分混勻,；然后在該試管中取100ul，棄掉,。第六只試管作為0 號標準品,。

注：為減少實驗誤差，保證準確性,，建議設(shè)置復孔,。

4）加樣：依照標準品的順序分別加入50ul的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入50ul的蒸餾水,；其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標記的抗體10ul,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

5）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

6）洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30 秒棄去,，如此重復5 次，拍干,。

7）加酶標溶液：標準品組,、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標溶液（空白對照孔除外）。

8）溫育：酶標板用封板紙密封后,，放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時,。

9）洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15-30s,，充分清洗酶標板5次,，用吸水紙*拍干。

10）顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后,，再加入顯色劑B液50ul,。

11）終止：25-37℃下避光反應10-15分鐘，加入50ul終止液,。

12）讀板：在450nm波長讀取各孔的OD值,。

注：讀板時必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡,，讀板時間控制在終止反應后的30分鐘內(nèi)，以免影響準確性,。

五．洗板方法
1.  手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次,。
2.  自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人C3,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應。

六．注意事項

1）實驗操作中必須使用一次性吸頭,，避免交叉污染,。

2）加樣：加樣時，要控制加樣速度,，避免*孔與zui后一孔間的時間間隔過大,，否則將會導致不同的預孵育時間，從而影響實驗的準確性以及重復性,。

3）孵育：嚴格按照說明書上規(guī)定的孵育時間和溫度進行,。

反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如果顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應,。

4）建議實驗前預測樣品含量，如樣品濃度過高,，應對樣品進行稀釋,，計算結(jié)果時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

5）建議使用本試劑盒時先做預實驗（即先做標準曲線,，試用幾個標本）,，如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經(jīng)銷商,，如果因運輸過程導致試劑盒失效,，可要求調(diào)換，但概不承擔產(chǎn)品本身以外的任何損失,。

七．計算
  以標準物的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標),，OD值為橫坐標(對數(shù)坐標)，在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：3.12 ng/ml - 200 ng/ml
zui低檢測限：0.78 ng/ml

八.ELISA試劑盒實驗操作的常見問題：

1. 問--客戶用48T試劑盒,，大概只有十個樣所以他一次用不完那么多板條,，但是他想做兩次，可封板膜只有一張,，那如果用完了怎么辦？可以用什么別的東西取代嗎,？

答--可以把封板膜剪掉,，用多少剪多少也可以用封口膜替代。
2. 問--實驗過程中溫育是放在哪溫育呢,？
答--可以在水浴箱,、細胞培養(yǎng)箱和烘干箱里面都行，只要恒定溫度為37度,。

九．“兔子內(nèi)皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA試劑盒"訂貨說明

1）賣方確保所訂產(chǎn)品與目錄技術(shù)指標保持*,；

2）為了確保買方產(chǎn)品在運輸中的質(zhì)量，對有特殊要求的低溫產(chǎn)品予以濕冰運輸,。

3）收到貨物后如出現(xiàn)質(zhì)量問題,，買方需在收到貨物一個月內(nèi)向賣方提出書面異議。買方逾期不提出異議,，視為貨物符合其要求,，賣方不付任何責任。

4）出現(xiàn)質(zhì)量以外的問題,，如破損等,，買方應在收貨后一個周內(nèi)提出。買方未按時提出異議,，視為該產(chǎn)品合格,。

本公司對所有售出的產(chǎn)品保證質(zhì)量，并提供良好的售后服務,，有關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的投訴,，請在收到貨物的32天內(nèi)以書面形式提出，并向我公司技術(shù)人員提供相應的材料,，我們會及時派人解決,。所有形式的賠償或退換僅限于產(chǎn)品本身,，不涉及其他間接內(nèi)容。凡購買本公司任意款elisa試劑盒,，均可享受免費代測服務,，并提供技術(shù)指導。