一．“兔子免疫球蛋白M(IgM)ELISA試劑盒 ”實驗原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性,。在測定時,，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開,。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例,。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析,。

二.計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，OD值為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
檢測范圍：3.12 ng/ml - 200 ng/ml
zui低檢測限：0.78 ng/ml

三．樣品收集,、處理及保存

1）.細胞培養(yǎng)上清：

適用于檢測體外培養(yǎng)的細胞分泌性成份。用無菌管收集細胞上清液,，以1000×g離心15分鐘,，收集上清。

2）細胞：

用PBS反復(fù)洗滌細胞3次,，調(diào)整細胞濃度達到104-106/ml 左右,，通過反復(fù)凍融，使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,，或者細胞超聲粉碎,，離心取上清液檢測。

3）血清：

在室溫下,，血液自然凝固,，以1000×g離心15分鐘，取上清待測,。

4）血漿：

應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘,，收集上清,。

5）體液：

包括胸腹水、腦脊液,，分泌物等,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘,，收集上清,。

6.）組織標(biāo)本：

切取組織標(biāo)本，稱取重量0.5mg,，加入500ul 的PBS,，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿,，以2000-3000 rmp離心20 分鐘,，收集上清進行檢測。

樣品中不能含有NaN3,，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

7）保存：

如果樣品不能立即檢測，應(yīng)將其分裝，-70 ℃保存,，避免反復(fù)冷凍,。保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。血液標(biāo)本盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

四．“兔子免疫球蛋白M(IgM)ELISA試劑盒”操作步驟

1）取出試劑盒,，室溫（20-25℃）放置30分鐘,。

2）分組：取出96孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理,。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組（6個濃度）、空白孔,、待測樣品組。

3）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備小試管6 只,，依次編好號碼,，先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100ul，然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul加入一只已編好號的試管中,，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中,，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第三只試管中,，充分混勻,；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中，充分混勻,；再在該試管中取100ul加入第五只試管中,，充分混勻；然后在該試管中取100ul,，棄掉,。第六只試管作為0 號標(biāo)準(zhǔn)品。

注：為減少實驗誤差,，保證準(zhǔn)確性,，建議設(shè)置復(fù)孔。

4）加樣：依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中,；空白對照孔加入50ul的蒸餾水,；其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標(biāo)記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

5）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

6）洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30 秒棄去,，如此重復(fù)5 次，拍干,。

7）加酶標(biāo)溶液：標(biāo)準(zhǔn)品組,、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標(biāo)溶液（空白對照孔除外）。

8）溫育：酶標(biāo)板用封板紙密封后,，放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時,。

9）洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15-30s,，充分清洗酶標(biāo)板5次,，用吸水紙*拍干。

10）顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后,，再加入顯色劑B液50ul,。

11）終止：25-37℃下避光反應(yīng)10-15分鐘，加入50ul終止液,。

12）讀板：在450nm波長讀取各孔的OD值,。

注：讀板時必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時間控制在終止反應(yīng)后的30分鐘內(nèi),，以免影響準(zhǔn)確性,。

五．?dāng)?shù)據(jù)計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，即為樣品的實際濃度,。

六．注意事項

1）實驗操作中必須使用一次性吸頭,，避免交叉污染。

2）加樣：加樣時,，要控制加樣速度,，避免*孔與zui后一孔間的時間間隔過大,，否則將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時間，從而影響實驗的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性,。

3）孵育：嚴(yán)格按照說明書上規(guī)定的孵育時間和溫度進行,。

反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如果顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),。

4）建議實驗前預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高,，應(yīng)對樣品進行稀釋,，計算結(jié)果時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

5）建議使用本試劑盒時先做預(yù)實驗（即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，試用幾個標(biāo)本）,，如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經(jīng)銷商,，如果因運輸過程導(dǎo)致試劑盒失效,，可要求調(diào)換，但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失,。

七．洗板方法
1.  手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
2.  自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人C3，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

八.ELISA試劑盒實驗操作的常見問題：
1. 問--客戶用48T試劑盒,，大概只有十個樣所以他一次用不完那么多板條，但是他想做兩次,，可封板膜只有一張,，那如果用完了怎么辦？可以用什么別的東西取代嗎,？
答--可以把封板膜剪掉,，用多少剪多少也可以用封口膜替代。
2. 問--實驗過程中溫育是放在哪溫育呢,？
答--可以在水浴箱,、細胞培養(yǎng)箱和烘干箱里面都行,，只要恒定溫度為37度。

九.“兔子免疫球蛋白M(IgM)ELISA試劑盒”訂貨說明

1）賣方確保所訂產(chǎn)品與目錄技術(shù)指標(biāo)保持*,；

2）為了確保買方產(chǎn)品在運輸中的質(zhì)量,，對有特殊要求的低溫產(chǎn)品予以濕冰運輸。

3）收到貨物后如出現(xiàn)質(zhì)量問題,，買方需在收到貨物一個月內(nèi)向賣方提出書面異議,。買方逾期不提出異議，視為貨物符合其要求,，賣方不付任何責(zé)任,。

4）出現(xiàn)質(zhì)量以外的問題，如破損等,，買方應(yīng)在收貨后一個周內(nèi)提出,。買方未按時提出異議，視為該產(chǎn)品合格,。

本公司對所有售出的產(chǎn)品保證質(zhì)量,，并提供良好的售后服務(wù)，有關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的投訴,，請在收到貨物的32天內(nèi)以書面形式提出,，并向我公司技術(shù)人員提供相應(yīng)的材料，我們會及時派人解決,。所有形式的賠償或退換僅限于產(chǎn)品本身,，不涉及其他間接內(nèi)容。凡購買本公司任意款elisa試劑盒,，均可享受免費代測服務(wù),，并提供技術(shù)指導(dǎo)。