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試驗原理

ELISA檢測試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將待測物質(zhì)和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育,。洗滌后,，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A、B,，和酶結(jié)合物同時作用,。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中待測物質(zhì)的濃度呈比例關(guān)系,。

產(chǎn)品規(guī)格

規(guī)格     可測樣數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)孔 空白對照     產(chǎn)地 庫存

96T      85個樣    10       1         進(jìn)口 現(xiàn)貨

48T      37個樣    10       1         進(jìn)口 現(xiàn)貨

自備材料

1）蒸餾水,。

2）加樣器：5ul,、10ul、50ul,、100ul,、200ul、500ul,、1000ul,。

3）振蕩器及磁力攪拌器等。

試劑盒組成

兔血管性血友病因子(VWF)ELISA試劑盒安全性

1）避免直接接觸終止液和底物A,、B,。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗,。

2）實驗中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品。

3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

樣品收集,、處理及保存方法

1）血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2）血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

3）細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4）組織勻漿-----將組織加入適量shengli鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,，取上清液

5）保存------如果樣品不立即使用,，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備

1）標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備,，不能儲存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。

2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟

1）使用前,，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差,。

2）根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。 每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。

3）加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物 素標(biāo)記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。

4）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3   次,。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。

5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘,。

6）甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

7）每孔加入底物A,、B各50ul,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘,。避免光照,。

8）取出酶標(biāo)板,，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果,。

9）在450nm波長處測定各孔的OD值,。

6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到精確的結(jié)果,。

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品,。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。

2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng),。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%,。

試劑盒選擇
◎衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑,，丙肝試劑，艾滋病試劑,，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格,，并貼有防偽標(biāo)簽的產(chǎn)品，試劑應(yīng)從靈敏度,，特異性,，精密度，穩(wěn)定性,，簡便性,，安全性及經(jīng)濟(jì)性作出全面的評價。
◎靈敏度：有二層含義,，1)為試劑檢出被檢物質(zhì)的zui低量的能力,；2)為試劑對人群或大量樣品中陽性檢出的能力(假陰性越少越好) ，取決于包被物的全面性,。
◎特異性：指試劑正確檢定不存在的被檢物質(zhì)的能力(無假陽性),，取決于包被抗原(體)及標(biāo)記抗原(體)
的純度及特異性。
◎精密度：ELISA 試劑一般指其批內(nèi)CV,，其值應(yīng)小于15%,；定量試劑應(yīng)同時考察線性范圍試劑盒選擇
◎穩(wěn)定性：試劑在規(guī)定條件下能儲存的時間，一般采用破壞性試驗即將試劑存放于37℃保存,，定期測定其靈敏度,，特異性和精密度等指標(biāo)，直到其質(zhì)量指標(biāo)開始下降為止,，通常認(rèn)為 37℃每穩(wěn)定一天相當(dāng)于4-10
℃保存一個半月,。
◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標(biāo)的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性試驗中結(jié)果判斷簡單明了,，)定量試驗結(jié)果計算也應(yīng)簡單,。
◎安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。
◎經(jīng)濟(jì)性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進(jìn)步降低成本而市場價格比較合理,。
試劑盒評價
◎試劑評價需要有的血清考核盤( Panel)進(jìn)行檢測,，一般實驗室不易從生檢所或臨檢中心取得，每進(jìn)一次試劑評價一次也很麻煩,?？梢酝ㄟ^間接的信息對試劑進(jìn)行選擇。
◎根據(jù)該試劑生檢所批批檢定報告,，了解其質(zhì)量水平,，按照質(zhì)量計劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；
◎通過詢問試劑包被物的組成,，如原料來源(基因工程或合成多肽),，片段的組合(按比例混合或化學(xué)合成)，片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣,；
◎參考室間質(zhì)評評價報告中對試劑的評價結(jié)果,，這比較客觀公正，因為統(tǒng)計數(shù)字均來自各參評醫(yī)院,，反映了試劑在某一地區(qū)的使用情況,；
◎根據(jù)部門發(fā)布的試劑評價結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣,。
儀器質(zhì)控
為使儀器保持*工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，所要控制的儀器包括移液器(加樣槍),，水浴箱(溫箱),，洗板機和酶標(biāo)儀。
◎移液器：ELISA 加樣量小(5-100ｕl),，其準(zhǔn)確性直接影響實驗結(jié)果,，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準(zhǔn)確,，一般應(yīng)在±10%以內(nèi),；
◎水浴箱 經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中(或溫箱內(nèi))實測溫度是否*，允許有±1℃的誤差,；
◎洗板機 每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ,，人工扣板時，墊紙不濕,，定期檢查管孔是否堵塞,；
◎酶標(biāo)儀 經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正,，使其保持良好的工作性能,。
附1：酶標(biāo)儀校正程序
◎濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標(biāo)儀上卸下，用UV-2201 型紫外-可見分光光度計(波長精度±0.3nm)于可見光區(qū)對每個濾光片進(jìn)行掃描,，其檢測值與標(biāo)定值之差為濾光片波長精度,。
◎通噵差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標(biāo)板小孔杯(杯底須光滑，透明,，無污染以酶標(biāo)板架作載體,，將其(內(nèi)含200ul 甲基橙溶液吸光度調(diào)至0.500A 左右)置于8 個通道的相應(yīng)位置，蒸溜水調(diào)零,，1 于490nm處連續(xù)測三次 ,觀察其不同通道的檢測器測量結(jié)果的*性,，可用極差值來表示?？组g差的測量是選擇同
一廠家,，同一批號酶標(biāo)2 板條(8 條共96 孔)分別加入 200ul 甲基橙溶液(吸光度調(diào)至0.100A 左右)先后置于同一通道，蒸溜水調(diào)零,于490nm 處檢測,，其誤差大小用±1.96s 衡量,。n 零點飄移(穩(wěn)定性觀察)：取8 只小孔杯分別置于8 個通道的相應(yīng)位置，均加入200ul 蒸溜水并調(diào)零,，于490nm 處每隔30 分鐘測一次,，觀察各個通道4 小時內(nèi)吸光度的變化。
附 1：酶標(biāo)儀校正程序
◎精密度評價：每個通道3 只小杯分別加入200ul 高中低3 種不同．濃度的甲基橙溶解,，蒸溜水調(diào)零,，于490nm作雙份平行測定，每日測二次(上下午各一次),，連續(xù)測定 20 天,。分別計算其批內(nèi)精密度，日內(nèi)批精密度,日間精密度和總精密度及相應(yīng)的CV 值,。
◎線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制 5 個系列的溶液,，于490nm 平行測8 次，取其均值,。計算其回歸方程,，相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)估計誤差 s，并用±1.96s 表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液,，分別加入3 種不同濃度的溶血液(測定波長為 490nm,，校正波長為585nm)，先后于8 個通道
檢測,，每個通道測3 次,，51 比較各組之間是否具有統(tǒng)計學(xué)差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果。
◎一般酶標(biāo)儀無 585nm 濾光片,，可選用550nm 或630nm 濾光片,。450nm 濾光片的檢定選用普魯蘭溶液(校正波長為630nm)

兔血管性血友病因子(VWF)ELISA試劑盒說明 
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2. 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且,，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn),。
4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。 
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。 
6. 中、英文說明書可能會有不*之處,，請以英文說明書為準(zhǔn),。
7. 所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8. 有效期：6個月