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試驗原理

ELISA檢測試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質濃度的標準品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測,。先將待測物質和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,，去除未結合的酶結合物,，然后加入底物A、B,，和酶結合物同時作用,。產生顏色。顏色的深淺和樣品中待測物質的濃度呈比例關系,。

產品規(guī)格

規(guī)格     可測樣數(shù) 標準孔 空白對照     產地 庫存

96T      85個樣    10       1         進口 現(xiàn)貨

48T      37個樣    10       1         進口 現(xiàn)貨

自備材料

1）蒸餾水,。

2）加樣器：5ul、10ul,、50ul,、100ul、200ul,、500ul,、1000ul。

3）振蕩器及磁力攪拌器等。

試劑盒組成

兔血清總補體ELISA試劑盒安全性

1）避免直接接觸終止液和底物A,、B,。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗,。

2）實驗中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品。

3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

樣品收集,、處理及保存方法

1）血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管,。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2）血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

3）細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4）組織勻漿-----將組織加入適量shengli鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,，取上清液

5）保存------如果樣品不立即使用,，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備

1）標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備,，不能儲存,。稀釋前將標準品振蕩混勻。

2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟

1）使用前,，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,，以免加樣時加入大量的氣泡,，產生加樣上的誤差。

2）根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標準品和空白孔建議做復孔,。 每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內,。

3）加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔,、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物 素標記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。

4）甩去孔內液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復此操作3   次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘。

6）甩去孔內液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。

7）每孔加入底物A、B各50ul,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘,。避免光照,。

8）取出酶標板，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應立即測定結果,。

9）在450nm波長處測定各孔的OD值。

6號標準品以上的結果為非線性的,，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結果,。

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990,。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應,。

3. 重復性：板內、板間變異系數(shù)均小于10%,。

試劑盒選擇
◎衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑,，丙肝試劑，艾滋病試劑,，梅毒試劑及血型試劑必須使用經衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格,，并貼有防偽標簽的產品，試劑應從靈敏度,，特異性,，精密度，穩(wěn)定性,，簡便性,，安全性及經濟性作出全面的評價。
◎靈敏度：有二層含義,，1)為試劑檢出被檢物質的zui低量的能力,；2)為試劑對人群或大量樣品中陽性檢出的能力(假陰性越少越好) ，取決于包被物的全面性,。
◎特異性：指試劑正確檢定不存在的被檢物質的能力(無假陽性),，取決于包被抗原(體)及標記抗原(體)
的純度及特異性。
◎精密度：ELISA 試劑一般指其批內CV,，其值應小于15%,；定量試劑應同時考察線性范圍試劑盒選擇
◎穩(wěn)定性：試劑在規(guī)定條件下能儲存的時間，一般采用破壞性試驗即將試劑存放于37℃保存,，定期測定其靈敏度,，特異性和精密度等指標，直到其質量指標開始下降為止,，通常認為 37℃每穩(wěn)定一天相當于4-10
℃保存一個半月,。
◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好,，在定性試驗中結果判斷簡單明了,，)定量試驗結果計算也應簡單。
◎安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性,。
◎經濟性：試劑在同等質量條件下通過大規(guī)模生產或技術進步降低成本而市場價格比較合理,。
試劑盒評價
◎試劑評價需要有的血清考核盤( Panel)進行檢測，一般實驗室不易從生檢所或臨檢中心取得,，每進一次試劑評價一次也很麻煩,?？梢酝ㄟ^間接的信息對試劑進行選擇。
◎根據(jù)該試劑生檢所批批檢定報告,，了解其質量水平,，按照質量計劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；
◎通過詢問試劑包被物的組成,，如原料來源(基因工程或合成多肽),，片段的組合(按比例混合或化學合成)，片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣,；
◎參考室間質評評價報告中對試劑的評價結果,，這比較客觀公正，因為統(tǒng)計數(shù)字均來自各參評醫(yī)院,，反映了試劑在某一地區(qū)的使用情況,；
◎根據(jù)部門發(fā)布的試劑評價結果，了解市場上試劑的質量優(yōu)劣,。
儀器質控
為使儀器保持*工作狀態(tài)應建立維護和校正儀器的標準操作程序(SOP),，所要控制的儀器包括移液器(加樣槍)，水浴箱(溫箱),，洗板機和酶標儀,。
◎移液器：ELISA 加樣量小(5-100ｕl)，其準確性直接影響實驗結果,，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水,，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內,；
◎水浴箱 經常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中(或溫箱內)實測溫度是否*,，允許有±1℃的誤差；
◎洗板機 每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ,，人工扣板時,，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞,；
◎酶標儀 經常維護其光學部分,，防止濾光片霉變，定期檢測校正,，使其保持良好的工作性能,。
附1：酶標儀校正程序
◎濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，用UV-2201 型紫外-可見分光光度計(波長精度±0.3nm)于可見光區(qū)對每個濾光片進行掃描,，其檢測值與標定值之差為濾光片波長精度。
◎通噵差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯(杯底須光滑,，透明,，無污染以酶標板架作載體,，將其(內含200ul 甲基橙溶液吸光度調至0.500A 左右)置于8 個通道的相應位置，蒸溜水調零,，1 于490nm處連續(xù)測三次 ,觀察其不同通道的檢測器測量結果的*性,，可用極差值來表示?？组g差的測量是選擇同
一廠家,，同一批號酶標2 板條(8 條共96 孔)分別加入 200ul 甲基橙溶液(吸光度調至0.100A 左右)先后置于同一通道，蒸溜水調零,于490nm 處檢測,，其誤差大小用±1.96s 衡量,。n 零點飄移(穩(wěn)定性觀察)：取8 只小孔杯分別置于8 個通道的相應位置，均加入200ul 蒸溜水并調零,，于490nm 處每隔30 分鐘測一次,，觀察各個通道4 小時內吸光度的變化。
附 1：酶標儀校正程序
◎精密度評價：每個通道3 只小杯分別加入200ul 高中低3 種不同．濃度的甲基橙溶解,，蒸溜水調零,，于490nm作雙份平行測定，每日測二次(上下午各一次),，連續(xù)測定 20 天,。分別計算其批內精密度，日內批精密度,日間精密度和總精密度及相應的CV 值,。
◎線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制 5 個系列的溶液,，于490nm 平行測8 次，取其均值,。計算其回歸方程,，相關系數(shù)及標準估計誤差 s，并用±1.96s 表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液,，分別加入3 種不同濃度的溶血液(測定波長為 490nm,，校正波長為585nm)，先后于8 個通道
檢測,，每個通道測3 次,，51 比較各組之間是否具有統(tǒng)計學差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果,。
◎一般酶標儀無 585nm 濾光片,，可選用550nm 或630nm 濾光片。450nm 濾光片的檢定選用普魯蘭溶液(校正波長為630nm)

兔血清總補體ELISA試劑盒結果判斷與分析

1,、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的待測物質標準品濃度為橫坐標（X）,，做得相應的曲線,，樣品的待測物質含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度,。