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滬鼎生物免疫沉淀技術(shù)服務(wù)流程
閱讀：778 發(fā)布時(shí)間：2015-6-3| 提 供 商 | 上海滬鼎生物科技有限公司 | 資料大小 | 24.5KB |
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免疫沉淀反應(yīng)主要用于抗原或者抗體的定性檢測(cè),。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當(dāng)比例所形成的可見沉淀物現(xiàn)象,。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計(jì)的沉淀實(shí)驗(yàn)主要包括絮狀沉淀試驗(yàn),，環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn),。凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)依所用的實(shí)驗(yàn)方法又可分為免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和免疫電泳技術(shù)2類。
免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法,。 其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物,，經(jīng)過洗脫,，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析,。
免疫沉淀操作流程（以Protein A Agarose方法為例）：
一,、蛋白樣品的準(zhǔn)備
1.對(duì)于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液,，PBS洗滌一次,，然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。
2.對(duì)于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解,。
3.對(duì)于懸浮細(xì)胞,，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次,，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解,。
二、去除非特異性結(jié)合
1.取200微升至1毫升蛋白樣品,，蛋白量約為200微克至1毫克,，加入約1微克和免疫沉淀時(shí)使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的Protein A Agarose，4℃緩慢搖動(dòng)30分鐘至2小時(shí),。
2.2500rpm(約1000g)離心5分鐘,，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。
三,、免疫沉淀
1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,，4℃緩慢搖動(dòng)放置一個(gè)晚上。
2.再加入20微升充分重懸的Protein A Agarose,，4℃緩慢搖動(dòng)1-3個(gè)小時(shí),。
3.2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心,，小心吸除上清,，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A Agarose。
4.用準(zhǔn)備蛋白樣品時(shí)的裂解液或PBS洗滌沉淀5次,，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升,。洗滌時(shí)離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟。
5.完成zui后一次洗滌后,，去除上清,，加入20-40微升1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀,，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底。
6.100℃或沸水浴處理3-5分鐘,，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳,，暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存。
免疫共沉淀：參考免疫沉淀的方法進(jìn)行,，但免疫共沉淀(co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品,。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳,。