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滬鼎生物免疫沉淀技術(shù)服務(wù)流程
閱讀：781 發(fā)布時間：2015-6-3| 提 供 商 | 上海滬鼎生物科技有限公司 | 資料大小 | 24.5KB |
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免疫沉淀反應(yīng)主要用于抗原或者抗體的定性檢測。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當(dāng)比例所形成的可見沉淀物現(xiàn)象,。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計的沉淀實驗主要包括絮狀沉淀試驗，環(huán)狀沉淀試驗和凝膠內(nèi)的沉淀試驗,。凝膠內(nèi)的沉淀試驗依所用的實驗方法又可分為免疫擴散實驗和免疫電泳技術(shù)2類,。
免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法,。 其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體,，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗脫,，收集免疫復(fù)合物,，然后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析。
免疫沉淀操作流程（以Protein A Agarose方法為例）：
一,、蛋白樣品的準(zhǔn)備
1.對于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞,，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次,，然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。
2.對于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解,。
3.對于懸浮細(xì)胞,，離心收集細(xì)胞后,，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解,。
二,、去除非特異性結(jié)合
1.取200微升至1毫升蛋白樣品，蛋白量約為200微克至1毫克,，加入約1微克和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的Protein A Agarose,，4℃緩慢搖動30分鐘至2小時。
2.2500rpm(約1000g)離心5分鐘,，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀,。
三、免疫沉淀
1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,，4℃緩慢搖動放置一個晚上,。
2.再加入20微升充分重懸的Protein A Agarose，4℃緩慢搖動1-3個小時,。
3.2500rpm(約1000g)離心5分鐘,，或瞬時高速離心，小心吸除上清,，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A Agarose,。
4.用準(zhǔn)備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升,。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟,。
5.完成zui后一次洗滌后，去除上清,，加入20-40微升1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀,，瞬時高速離心把樣品離心至管底。
6.100℃或沸水浴處理3-5分鐘,，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳,，暫時不用的樣品可以-20℃保存。
免疫共沉淀：參考免疫沉淀的方法進(jìn)行,，但免疫共沉淀(co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品,。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳,。