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滬鼎分享實驗:免疫組化,,八步驟三特點

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步驟

1、石蠟切片置于67℃烘箱中,,烘片2小時,,脫蠟至水,用pH7.4的PBS沖洗三次,,每次3分鐘(3×3’),。
2、取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液,,加入微波盒中,,微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,,放入已沸騰的緩沖液中,,中檔微波處理10分鐘,取出微波盒流水自然泠卻,,從緩沖液中取出玻片,,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS沖洗2×3’,。
3,、每張切片加1滴3%H2O2,室溫下孵育10分鐘,,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,。PBS沖洗3×3’。
4,、除去PBS液,,每張切片加1滴相應(yīng)的*抗體(相應(yīng)稀釋倍數(shù)),室溫下孵育2小時,。
5,、PBS沖洗3×5’。除去PBS液,,每張切片加1滴聚合物增強劑,,室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’,。
6,、除去PBS液,,每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物,室溫下孵育30分鐘,。PBS沖洗3×5’,。
7、除去PBS液,,每張切片加1滴新鮮配制的DAB液(二氨基聯(lián)苯胺),,顯微鏡下觀察5分鐘。
8,、蘇木素復染,,0.1%HCl分化,自來水沖洗,,藍化,,切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,,中性樹膠封固,,晾干后觀察。

特點
1,、在切片加上一抗后,,第二抗體標記多聚螯合物酶(HRP)的復合物與一抗結(jié)合,在多聚螯合物上有大量的HRP分子,,使抗原信號有顯著的放大,,其敏感性較SABC、SP法高,。
2,、由于多聚物在體內(nèi)不存在,又不使用生物素,,從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色,,背景比SABC、SP法清晰,。
3,、辣根過氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上,替代傳統(tǒng)方法的 二抗,、三抗,,減少了實驗步驟,且試劑孵育時間短,,只需15分鐘,,使得免疫組化方法更簡單,實驗時間比SABC,、SP法大為縮短,。

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