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過(guò)碘酸鈉法在抗體的標(biāo)記方法
閱讀：1866 發(fā)布時(shí)間：2013-7-18| 提 供 商 | 上海滬鼎生物科技有限公司 | 資料大小 | 8.1KB |
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過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記HRP抗體的方法
過(guò)碘酸鈉法
本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合,，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70%的HRP和Ig結(jié)合,，99%的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無(wú)重大損失,，是目前zui常用的方法,。
1. 原理
經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來(lái)Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟,。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼,，后者可進(jìn)一步用NaBH4（或乙醇胺）還原穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體,。
2. 標(biāo)記步驟
（1）稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
（2）于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,，室溫下避光攪拌20分鐘,。
（3）將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析,，4℃夜,。
（4）加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5,，然后立即加入10mg IgG（抗體,，或SPA 5mg）在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí),。
（5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,，混勻，再置4℃ 2小時(shí),。
（6）將上述液裝入透析袋中,，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過(guò)下夜,。
其余步驟（純化）同戊二醛標(biāo)記步驟的（6）,、（7）、（8）,。
3. 結(jié)果判定
除標(biāo)記物IgG量的計(jì)算,，略有不同以外，其余均同戊二醛法,。
IgG量（mg/ml）＝（OD280nm-OD403nm×0.3）×0.62
4. 試劑及器材
（1）0.1M NaIO4：稱取241mg高碘酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠,，批號(hào)830602）溶于蒸餾水10ml中。
（2）1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2M NaAc （1.361克/50ml） 3.7ml,；0.2M HAc （0.601ml/50ml） 6.3ml,；加蒸餾水至2,000ml,。
（3）0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g,；加蒸餾水至50ml,，再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液,。
（4）NaBH4溶液（4mg/ml）：臨用時(shí)稱取NaBH4 4mg溶于1ml蒸餾水中,。
（5）其它的試劑及器材可參見(jiàn)戊二醛標(biāo)記法。
ELISA測(cè)定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法,、間接法,、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法,、競(jìng)爭(zhēng)抑制法,，其中競(jìng)爭(zhēng)抑制法（HBeAb,HBcAb等采用）因受操作時(shí)差所引起的不公平競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響，結(jié)果重復(fù)性較差,，質(zhì)量較難控制,。選擇滬鼎生物，您將得到高質(zhì)量的產(chǎn)品,、實(shí)惠的價(jià)格、的服務(wù),、快捷的到貨,、穩(wěn)定的貨源,、