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酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法操作步驟
閱讀：3137 發(fā)布時(shí)間：2015-9-1酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法是ELISA方法中的一種,，目前國內(nèi)很少客戶用這種方法檢測(cè)，一般都是用的雙抗體夾心法及間接法,，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法國內(nèi)很少客戶用這種方法檢測(cè)，但是我們也該清楚他們的操作步驟,，下面讓我們一起來看看我司錢為客戶準(zhǔn)備的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法操作步驟：
1.用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板,，室溫下孵育10分鐘。
2.倒去酒精,，用100ul PBS洗滌3次,。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合,，每孔加100ul,，蓋上板蓋。
4. 倒去液體,，100ul PBS洗滌一次,。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS(見試劑準(zhǔn)備)，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時(shí),。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打,，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次,。
8.每孔加入100ul細(xì)胞懸浮液(含適當(dāng)量的細(xì)胞和相應(yīng)濃度的刺激劑),。細(xì)胞可預(yù)先在體外接受刺激(間接Eli-spot)。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的 96孔板塑料板蓋,，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時(shí)間(15-20小時(shí)),。這期間不要晃動(dòng)或移動(dòng)孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打,，倒去液體,。
10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘,。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次,。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測(cè)抗體，此為一板的量,。每孔加100ul此液體,，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時(shí)30 分,。
13.倒去液體,，用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶,。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋,，37℃孵育1小時(shí),。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次,。在吸水紙上拍打,，吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT,。
17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘,。*顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中,。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊,。吸水紙上輕拍，使膜干燥,。保存時(shí),，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點(diǎn)數(shù)。4℃下放置一 夜,，點(diǎn)會(huì)比較明顯,。此板在室溫下避光保存。