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ATCC細(xì)胞冷凍？又如何解凍,？
閱讀：949 發(fā)布時(shí)間：2014-1-10時(shí)間過(guò)的可真快呀，一月份都已經(jīng)過(guò)去三分之一啦,，等待春節(jié)的到來(lái),，真是激動(dòng)人心的，元旦剛過(guò),，就是臘八節(jié)了,，我公司還開(kāi)展了臘八*一周的*活動(dòng)哦！想了解的朋友們可以,。
在昨天下午的時(shí)候,，我公司接到了一個(gè)咨詢(xún)有關(guān)細(xì)胞冷凍的朋友來(lái)電，我公司很快地到了技術(shù)部人員為這位朋友解決了問(wèn)題,。細(xì)胞也為我公司主營(yíng)產(chǎn)品之一,，我公司王提出應(yīng)將ATCC細(xì)胞冷凍及解凍方法發(fā)布出來(lái)分享給其他的朋友們。
ATCC細(xì)胞冷凍,？又如何解凍,？
細(xì)胞冷凍及保存
材料：
生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基,、DMSO,、無(wú)菌塑料冷凍保存管、0.4％（w/v）trypan blue,、血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片,、等速降溫機(jī)。
冷凍保存方法：
1,、傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(shí)（或隔夜）→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。-20℃不可超過(guò)1小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大,，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些,。
2,、程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃,，再放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存,。
步驟：
1,、冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形,。
2,、配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5～10％,，混合均勻,，置于室溫下待用。
3,、依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液（約0.1ml）計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率,。
4,、離心，去除上清液,，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml,，混合均勻,，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/vial,，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè),。
朋友們可要注意嘍：
1、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好（logphase）且存活率高之狀態(tài),，約為80–90％致密度,。
2、冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生,。
3、注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì),。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，無(wú)菌且無(wú)色（以0.22micron FGLP flon過(guò)濾或是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650）,，以5～10ml小體積分裝,，4℃避光保存，勿作多次解凍,。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以高壓蒸汽滅菌后避光保存,。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性,。
ATCC細(xì)胞
冷凍保存之細(xì)胞濃度：
1,、normal
human fibroblast:1～3×106cells/ml
2、hybridoma：1～3×106cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高,，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。
3,、adherent tumor
lines：5～7×106,，依細(xì)胞種類(lèi)而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,，而HeLa只需1～3×106cells/ml
4,、other
suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml,。
5,、冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時(shí),，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗,。
冷凍細(xì)胞活化
1,、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害,，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡,。
2、細(xì)胞活化后,，約需數(shù)日,，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常（例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì)）,。
材料：37℃恒溫水槽,、新鮮培養(yǎng)基、無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶,、液氮或干冰容器 ,。
步驟：
1、操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,，防止冷凍管可能爆裂之傷害,。
2、自液氮或干冰容器中取出冷凍管,，檢查蓋子是否旋緊,，由于熱脹冷縮過(guò)程,，此時(shí)蓋子易松掉。
3,、將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),。
4,、取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),。
5,、取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)（稀釋比例為1：10～1：15）,，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試,。
6,、解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑（例如DMSO或glycerol），依細(xì)胞種類(lèi)而異,，一般而言,，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除,，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm,，5分鐘,，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基,，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
7,、若不需立即去除冷凍保存劑,，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
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