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冰凍切片的免疫組化染色具體操作步驟
閱讀：1633 發(fā)布時(shí)間：2013-10-181. 新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片（ 也可- 80℃保存）,，厚度為 5～6μm,。
2. 載玻片可不打底，裱片后,，立即用電吹風(fēng)吹干,。
3. 如不馬上染色，可密封后- 20℃保存,。
4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘,。
5. PBS 洗 2 次,，每次 5 分鐘，（ 必要時(shí)應(yīng)用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔）
6. 3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,，20 分鐘,，避光;
7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘;
8. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片,，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤狀態(tài),）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動物血清）處理,，37℃，15 分鐘,。
附：正常血清配制 （ 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制）：按 1:20比例,，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl （10%拋灑量） 計(jì)算,。
9.滴加*抗體：用濾紙吸去血清,，不洗，直接滴加*抗體,，37℃ 2 小時(shí)（也可置于 4℃冰箱過整夜） ,。
10.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） ,。
11.滴加生物素化的二抗,，37℃，40 分鐘,。
12.PBS：5 分鐘,，2 次（置于搖床） 。
13.滴加三抗 （SAB 復(fù)合物） ,，37℃,，40 分鐘。
14.PBS：5 分鐘,，2 次（置于搖床） ,。
15.DAB 顯色，鏡下觀察,，適時(shí)終止（自來水沖終止） ,。
附：DAB 的配制① 儲備液（DAB 25mg/ml）的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分裝成 1ml,，100μl,，50μl ，20μl 等,，-20℃,，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl
16.自來水（細(xì)水）充分沖洗,。
17.蘇木素復(fù)染,，室溫,，30 秒，自來水沖洗,。
18.自來水沖洗返藍(lán),，15 分鐘。
19.梯度酒精脫水：80%,，2 分鐘 95%,，2 分鐘 100%，2 次,，5 分鐘,。
20.二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘
21.封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片,。