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操作elisa的方法與注意事項
閱讀：1438 發(fā)布時間：2013-9-30操作elisa的方法與注意事項
似乎很多做elisa實驗的人都非常關(guān)注它的操作方法，其次就是它的原理啊概念啊什么的,，其實還需要較為關(guān)注的就是操作的同時有哪些注意事項,，關(guān)于elisa的各個方面有很多，今天,，上海滬鼎生物的技術(shù)部工作人員來為大家分享一下 elisa的操作方法與它的注意事項,。
今天我們重點說的是elisa的操作方法與注意事項，但是我們也先來看一看它的原理,，elisa是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù),。
然而由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后,，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中,，通過不同的設(shè)計,，具體的方法步驟可有多種。比較常用的是elisa雙抗體夾心法及elisa接法。
說完elisa的原理,，我們再來說說操作elisa的幾種方法,，方法一就是用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法，1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml,。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,，4℃。次日,，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘,。（簡稱洗滌,，下同）。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,，置37℃孵育1小時,。然后洗滌。（同時做空白孔,，陰性對照孔及陽性對照孔）,。3.加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml,。37℃孵育0.5～1小時,，洗滌。4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,，37℃10～30分鐘,。5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
結(jié)果判定為：可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺,，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以“+”、“-”號表示,。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上,，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處,，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性,。
方法二就是用于檢測未知抗體的間接法,，用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml,，每孔加0.1ml，4℃,。次日洗滌3次,。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白,、陰性及陽性孔對照）于反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘,，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌,。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5,、6。
以上就是elisa的操作方法,，注意事項有兩點,。*點是在正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,，待檢樣品應(yīng)作一式二份,，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高,，說明有非特異性反應(yīng),，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉,。
還有一點就是在elisa中,，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括了四小點,，
（1）.固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯、聚苯乙烯,、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板、試管,、珠粒等,。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被,，在同一實驗條件下進行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。
（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時,，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度,，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時,。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進行包被后,，在其它試驗條件相同時,，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度,。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml,。
（3） 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物,、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度,。
（4） 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全,、有明顯地顯色反應(yīng),，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用,，應(yīng)注意防護,。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng),。通常底物作用時間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。
其實我們在以上說了三塊內(nèi)容，elisa的操作方法,，還有注意事項,，其中還包括了原理，關(guān)于elisa的方方面面有很多,，在這里我們今天呢就說這些,，想了解更多資料，歡迎關(guān)注上海滬鼎生物,。我司國慶期間有優(yōu)惠*打折活動,，而且有買就有送，我們忠誠的期待您的來電,，上海滬鼎生物恭祝朋友們生活愉快,！
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2013-9-29