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免疫親和純化有那三個主要影響因素
閱讀：1370 發(fā)布時間：2013-8-5免疫親和純化有那三個主要影響因素
影響免疫親和純化的因素有多種,，其中zui關(guān)鍵的3個因素是：抗原zui初的純度原與抗體的親和力以及抗原抗體結(jié)合是否容易發(fā)生解離,。
*大因素：哪種抗原相對容易被洗脫。這*由抗原—抗體相互作用的結(jié)合鍵的類型和數(shù)量來決定,，因此這與抗體的親和力有關(guān),。然而親和力并不決定抗原是否容易洗脫。用于免疫親和純化的理想抗體是對抗原具有高親和力,，與抗原的結(jié)合可被一種易于操作的簡單而且溫和的方法如pH值的改變而逆轉(zhuǎn),。這些操作的設(shè)計將在后文闡述。在設(shè)計免疫親和純化的方法時,，通常認為zui重要的是選擇抗體和洗脫條件,，在數(shù)種不同的洗脫條件下測試若干份有潛在使用價值的抗體，可發(fā)現(xiàn)高親和力與容易洗脫的優(yōu)化組合,。
第二大因素：在免疫親和純化技術(shù)中,，抗原zui初的相對濃度是決定zui終產(chǎn)物純度極為重要的因素，因為抗原一抗體的反應具有相當高的特異性,，故而沒有任何其他層析技術(shù)能經(jīng)過一步純化得到如此高的純度,。然而，純化的程度不是無限的,，因為使用親和層析柱亦有某些內(nèi)在的背景限制,，常規(guī)純化可以達到1000倍，大多數(shù)純化可達10 000倍,。如果所研究的蛋白質(zhì)抗原非常，免疫親和純化必須與其他方法結(jié)合,，才能獲得均質(zhì)性產(chǎn)物,，這可以在免疫親和層析之前或其后采用其他的純化步驟來完成。常用的方法是在進行免疫親和層析之前先將樣品通過一種或多種標準層析柱,。還可將免疫親和層析純化的產(chǎn)物先經(jīng)過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳,，再轉(zhuǎn)印到膜上進行微量測序。上述各種樣品,，由于已通過用其他方法增加其總純度,，再進行免疫親和層析即可達到純化。
第三大因素：抗體對相應抗原的親和力是免疫親合純化法遇到的zui麻煩的問題，抗體的親和力將決定從含抗原的溶液中提取抗原的總量,，高親和力的抗體（>108mol／L）能在1h以內(nèi)達到有效地分離,；而低親和力的抗體（106mol／L）即使在高濃度時也不能結(jié)合溶液中的全部抗原。值得注意的是,，免疫親和純化達到平衡所需的總時間比其他方法如免疫沉淀顯著延長,，因為抗體是結(jié)合到固相支持物上，這樣就大大減慢了結(jié)合速度,。由此亦可采用其他更有效的免疫化學技術(shù)來捕捉抗原,，如使用多克隆抗體來識別同一抗原上的多個表位，但這種方法對大多數(shù)免疫親和純化并不適合,。正如預期的那樣,，通過這些方法增強親和力可結(jié)合較多的抗原，但是在洗脫抗原時,，也會遇到很多始料不及的問題,。如果zui終的目的是純化保持原有特性的蛋白，那么只能選擇識別1個表位或1個短肽序列的抗體,。只有當所需的zui終產(chǎn)物為變性蛋白時,，才選用識別多個表位的抗體。
在設(shè)計免疫親和純化的實驗中,，常見的錯誤是將低親和力和容易洗脫等同看待,。盡管這在某些低親和力抗體的應用上得到證實，但通常并非總是如此,，連接抗原與抗體的結(jié)合鍵,，在高親和力和低親和力抗體都是同一類型（第二章）。例如,，高親和力和低親和力的抗體都可通過鹽橋和抗原結(jié)合,，并且是疏水作用。在這兩種情況下洗脫抗原都需要將結(jié)合鍵破壞,，因此,，選擇洗脫條件就存在相同的問題。此外,，低親和力抗體還會帶來新的問題,，包括結(jié)合容量低；在洗脫時,，連續(xù)不斷從層析柱中濾去抗原,，形成一個較為平坦的峰，而不是陡峭的洗脫峰,。
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